Агароза

Как и две предыдущие матрицы, агароза является полисахаридом, т. е. полиатомным спиртом. Ее элементарным звеном служит дисахарид агаробиоза, в состав которого входит сахар – 3,6-ангидро-L-галактоза. Из-за этого агароза более устойчива к действию микроорганизмов, чем целлюлоза и сефадексы, однако ее тоже следует хранить в присутствии антисептика. Агароза очень гидрофильна, а ее полимерные нити еще в большей степени, чем нити целлюлозы, склонны к образованию водородных связей. Благодаря этому горячий 2-6%-ный раствор агарозы застывает в виде жесткого и очень крупнопористого геля. Нити полимера собираются в пучки и образуют жесткий пространственный каркас с пустотами внутри. При температуре около 100°С гель агарозы плавится, поэтому его нельзя автоклавировать: в случае необходимости гель приходится стерилизовать раствором диэтилпирокарбоната. Модификация агарозы может происходить также по гидроксильным группам, плотность расположения которых, однако, значительно ниже, чем у сефадексов, поскольку на звено дисахарида их приходится четыре вместо шести. Положение усугубляется тем, что внутри плотно упакованных пучков нитей гидроксильные группы недоступны для модификации. В условиях хроматографии агароза химически неактивна, но уязвима для действия кислот, щелочей и окислителей. Рабочий диапазон рН при использовании матриц из обычной агарозы лежит в пределах 4-9. Агароза выдерживает непродолжительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидинхлоридом, которые все же постепенно ее разрушают. Поскольку агароза для хроматографии представляет собой водный гель, о набухании ее говорить не приходится. Но следует помнить о том, что агарозу нельзя сушить ввиду необратимой деструкции геля. Агароза для хроматографии поставляется в виде суспендированных в воде сферических гранул диаметром 60— 200 мкм, которые в таком виде и следует хранить. При кратковременном обсыхании колонки, заполненной агарозой, пока гранулы не начали терять находящуюся в них жидкость, хроматографическне характеристики сорбента еще могут быть восстановлены. Если же подсыхание гранул началось, то гель приходится выбрасывать. Размер пор (пустот) в гранулах зависит от процентного содержания агарозы в геле (2, 4 или 6%). Связанные с агарозой остатки сульфокислоты (до 0,5% по массе) могут сорбировать щелочные белки. Эта сорбция подавляется в присутствии 0,02 М NaCl или другой соли. Гранулированную агарозу для гель-фильтрации и синтеза аффинных сорбентов выпускают следующие фирмы: «Pharmacia» — под торговым названием «Sepharose», «Bio-Rad» — под названием «Bio-Gel A», «LKB» (Швеция) и «IBF» (Франция) — под названием «Ultrogel А».

Для повышения химической и термической стойкости матриц фирма «Pharmacia» разработала вариант гелей агарозы, в которых нити полимера дополнительно химически «сшиты» обработкой 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочной среде. Матрицы на основе такой «сшитой» агарозы носят общее наименование «Sepharose CL». Их можно использовать в значительно более широком диапазоне рН (3—14) и даже автоклавировать при температуре 120°С. Они обладают еще большей жесткостью, выдерживают длительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидинхлоридом, а также со многими органическими растворителями (этанолом, ацетоном, хлороформом, пиридином, ацетонитрилом, дихлорэтаном, ДМФ, ДМСО и др.). Последнее обстоятельство имеет важное значение для осуществления реакций модификации.

В настоящее время агароза широко применяется как в колоночной хроматографии в виде модифицированных сорбентов состоящих из сферических гранул строго определенного размера (Q-Sepharose, SP-Sepharose, Phenyl-Sepharose и т.д.), так и в виде гелей, в основном применяемых для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот при молекулярно-биологических и биотехнологических исследованиях.

Кизельгур (целит, диатомовая земля)

Под этими названиями фигурирует большое число различных крупнопористых материалов, представляющих собой окаменевшие панцири древних диатомовых водорослей. Кизельгуры примерно на 90 % состоят из SiO2, а также содержат 4 % Аl2О3 и менее значительные примеси окислов других металлов, в том числе около 1,4% Fe2O3. Окислы железа удаляют обработкой 10%-ной НСl, материал сушат при 110°С, перемалывают, отсеивают и поставляют в виде жестких и очень пористых гранул. Они гидрофильны, химически инертны и обладают высокой адсорбционной способностью. Кизельгуры широко используют в качестве основы матриц для распределительной хроматографии в обращенных фазах (ХОФ). Для этой цели поверхность гранул и пор силиконируют обработкой парами диметилдихлорсилана и промывают метанолом. Из особо хорошо очищенных кизельгуров типа «Chromosorb», выпускаемых главным образом в качестве носителей для газовой хроматографии, для целей жидкостной ХОФ лучше всего подходит силиконированный «Chromosorb W» (фирма «Johns-Manville»). На 1 г этого сорбента можно иммобилизовать до 0,9 мл неполярной жидкости, служащей неподвижной фазой для ХОФ.