Теоретичні відомості

Дата добавления: 2015-09-19; просмотров: 488

РАБОТА 5. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ

Цель работы: ознакомиться с каталитическим действием некоторых ферментов пищеварительного тракта (амилазы слюны, пепсина и липазы) и каталазы крови.

Задачи:

· проделать предложенные реакции;

· написать уравнения реакций, катализируемых исследуе-мыми ферментами;

· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Ферменты (энзимы) – простые и сложные белки, катализирующие определённые химические реакции в организме. Так, амилаза слюны катализирует гидролиз α-1,4-глюкозидных связей крахмала и гликогена, что приводит к образованию декстринов, а затем мальтозы. Панкреатическая липаза превращает ацилглицерины в глицерол и жирные кислоты. Фермент желудочного сока пепсин ускоряет гидролитический распад белков до пептидов. Каталаза расщепляет пероксид водорода на воду и молекулярный кислород.

При ознакомлении с действием фермента сравнивают результаты энзиматической реакции с контрольными пробами, полученными в отсутствие фермента.

1. Ознакомление с действием амилазы слюны

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны, а в другую (контроль) – 0,5 мл дистиллированной воды. Содержимое каждой пробирки перемешивают, и пробы помещают в термостат при 37˚С на 15 минут. Затем в обе пробирки добавляют по 1-2 капли раствора Люголя (раствор йода в растворе KI). В контрольной пробирке появляется синее окрашивание, а в опытной (с амилазой слюны) такая окраска не развивается.

Уравнение реакции действия амилазы слюны на крахмал:

2. Ознакомление с действием липазы

Ход работы. В две пробирки наливают по 4 мл дистиллированой воды, 5 мл 1%-го раствора бикарбоната натрия и 1 мл растительного масла. Содержимое пробирок энергично встряхивают до образования эмульсии и в обе пробирки добавляют по 3 капли 0,5%-го спиртового раствора фенолфталеина. Затем в одну пробирку приливают 1 мл раствора липазы, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Содержимое снова энергично встряхивают и пробирки ставят в термостат при 37˚С на 15-20 минут. В пробирке с липазой раствор становится менее окрашенным или обесцвечивается, в контрольной - остается розовым.

Уравнение реакции действия панкреатической липазы на триацилглицеролы (ТАГ):

3. Ознакомление с действием пепсина

Ход работы. В две пробирки наливают по 2 мл 1%-го раствора альбумина и денатурируют его нагреванием. Пробирки охлаждают до комнатной температуры, а затем в одну из них добавляют 1 мл раствора пепсина, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Обе пробы помещают в термостат при 37˚С на 15 минут. В пробирке с ферментом муть исчезает.

Уравнение реакции действия пепсина на альбумин:

4. Ознакомление с действием каталазы

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл свежеприготовленного 5%-го раствора перекиси водорода и в одну из них добавляют 1 каплю крови, в которой содержится фермент каталаза. В пробирке с каталазой наблюдается интенсивное выделение пузырьков кислорода.

Уравнение реакции разложения перекиси водорода каталазой:

Выводы:

РАБОТА 6. изучение свойств ферментов. Влияние на активность фермента реакции среды

и температуры, Субстратная специфичность

Цель работы: на примере амилазы слюны ознакомиться с некоторыми специфическими свойствами ферментов.

Задачи:

· проделать необходимые реакции;

· проанализировать полученные результаты и сформулиро-вать выводы;

· написать уравнения реакций каталитического расщепле-ния крахмала амилазой слюны.

Скорость ферментативных реакций зависит от температуры и концентрации водородных ионов в среде. Каждый фермент имеет свой оптимум рН и температуры, при которых активность фермента максимальна.

1. Влияние температуры на активность амилазы

Ход работы. В три пробирки вносят по 1 мл разбавленной в 10 раз слюны, одну из них помещают в термостат с температурой 37˚С, вторую – в кипящую водяную баню и третью – в лёд. Через 5 минут во все пробирки добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, перемешивают. Первую и вторую пробирки помещают в термостат, а третью – в прежние условия (лёд). Через 10 минут во все пробы добавляют по 3 капли раствора Люголя и перемешивают. Сравнивают окраску растворов и объясняют причину выявленных различий.

2. Определение оптимума рН активности амилазы

Ход работы. Перед началом работы готовят раствор амилазы разведением слюны в 10 раз. Для этого собирают 0,5 мл слюны в мерную пробирку, добавляют 4,5 мл дист. Н₂О и раствор тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

В восемь пронумерованных пробирок наливают по 2 мл фосфатного буферного раствора соответственно с рН 5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 6,8; 7,0; 7,4; 8,0. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,4%-го раствора крахмала (приготовленного на 0,1% растворе NaCl) и содержимое перемешивают стеклянной палочкой.

Затем быстро добавляют («веером») по 0,5 мл разведенной в 10 раз слюны, сначала в 5- и 4-ю пробирки, затем в 3-ю и 6-ю, далее во 2-ю и 7-ю и, наконец, в 1-ю и 8-ю пробирки. После добавления слюны содержимое каждой пробирки сразу же перемешивают. Отмечают время перемешивания раствора в 5-й пробирке, пробы помещают в термостат (37˚С).

Через 2-3 минуты 1 каплю жидкости из 5-й пробирки переносят стеклянной палочкой на предметное стекло и добавляют 1 каплю раствора Люголя. Если жёлтая капля Люголя окрашивается в синий или красно-коричневый цвет, то выжидают ещё 2 минуты и снова повторяют реакцию на наличие крахмала с каплей раствора из 5-й пробирки. Реакцию на предметном стекле повторяют через каждые 2 минуты до появления оранжево-красного или жёлто-коричневого цвета. После этого реакцию во всех пробирках быстро останавливают, приливая во все пробирки по 5 капель раствора Люголя, перемешивают и сравнивают окрашивание.

Оптимальное значение рН действия для амилазы определяют по пробирке с самым светлым (светло-жёлтым) окрашиванием.

Примечание. При низкой комнатной температуре после добавления слюны пробы помещают в термостат при 37˚С, периодически (через 2-3 минуты) проверяя раствор в 5-й пробирке на наличие крахмала.

3. Специфичность действия амилазы

Одним из свойств ферментов является специфичность их действия. Ферменты специфичны по отношению к типу катализируемой реакции и к субстрату, на который они действуют. Высокая специфичность ферментов определяется тем, что только строго определённые функциональные группы активного центра фермента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса. Амилаза обладает относительной специфичностью, гидролизуя α-1,4-гликозидные связи в крахмале и других соединениях, имеющих такой тип связи.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5 мл слюны и в одну из них добавляют 2 мл 0,5%-го раствора крахмала, а в другую – 2 мл 0,5%-го раствора сахарозы. Содержимое каждой пробирки перемешивают стеклянной палочкой, и пробы помещают в термостат при 37˚С на 20 минут. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия, по 0,5 мл 5%-го раствора сульфата меди и после перемешивания нагревают до кипения. В пробирке, содержащей крахмал, выпадает красный или жёлтый осадок (положительная проба Троммера).

Выводы:

РАБОТА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИНОТРАНСФЕРАЗ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО МЕТОДУ КИНГА

Цель работы: ознакомиться с одним из методов колориметрического определения активности аминотрансфераз, широко используемых в медицинской практике для выявления заболеваний.

Задачи:

· ознакомиться с предложенным методом определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови;

· провести анализ и сделать выводы.

Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз) крови имеет большое диагностическое значение. Например, при инфаркте миокарда в крови увеличена активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ), при инфекционном гепатите – активность аланинамино-трансферазы (АлАТ). Кроме того, в клинической практике рассчитывают коэффициент де Ритиса (АсАТ/АлАТ), который в норме составляет 1,33±0,42. При сердечно-сосудистых патологиях коэффициент увеличивается, а при печёночных – уменьшается.

Принцип метода. Метод Кинга основан на способности аланин- и аспартаттрансаминаз конденсировать 2,4-динитрофенилгидразин и продукты дезаминирования аминокислот - пировиноградную и щаве-левоуксусную кислоты:

Ход работы. В одну пробирку (опытная проба) вносят 0,2 мл сыворотки крови, в другую (контрольная проба) - 0,2 мл дистиллированной воды; в обе пробирки добавляют по 0,5 мл 2%-го раствора аспарагиновой кислоты и по 0,5 мл 0,6%-го раствора α-кето-глутаровой кислоты. Пробы перемешивают и помещают на 60 минут в термостат (37˚С), после чего каталитическое действие фермента останавливают добавлением в обе пробы по 1 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина и вновь помещают в термостат на 15 минут. Затем добавляют по 10 мл 0,4 н раствора NaOH и оставляют на 1-2 минуты до появления окраски. Пробы колориметрируют на ФЭКе с зелёным светофильтром в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Активность аминотрансфераз выражают в условных единицах, умножая оптическую плотность на 100.

У здоровых людей активность аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови составляет 10-35 единиц.

Результаты:

Выводы: