XIV. Визначення групи крові і Rh-фактораСлід враховувати, що еритроцити містять групові антигени (аглютиногени) А, В або обидва, а в сироватці крові є групові антитіла (аглютиніни) a і b. Реактиви і обладнання: стандартні сироватки групи 0 (I), А (II), В (III), АВ| (IV), стандартні еритроцити групи А (II) і В (III), фізіологічний розчин хлориду натрію (0, 9% розчин NaCl), предметне скло та білі тарілки (або спеціальні планшети), скарифікатор, очні піпетки, вата, спирт, настойка йоду, пісочний годинник на 5 хв, олівець по склу. При визначенні групи крові простою реакцією використовують дві серії стандартних гемаглютинуючих сироваток з титром не нижче 1: 32. На лівому боці тарілки або планшета надписують 0 (I), в середині А (II), на правій стороні В (III), обов'язково відзначають прізвище хворого. Наносять 2-3 краплі ізогемаглютинуючих сироваток відповідно до зроблених позначок. У кожну краплю сироватки додають в 5-10 разів меншу кількість досліджуваної крові. Краплі ретельно змішують. Результат реакції враховують через 5 хвилин. Якщо аглютинація з'явилася нечітка, до суміші сироватки і крові додають по одній краплі фізіологічного розчину. Оцінка результатів така: а) якщо у всіх трьох краплях аглютинації немає, кров не містить антигенів А і В, тобто належить до групи О (I); б) поява аглютинації в краплях з сироватками першої групи, що містить ізогемаглютиніни α і третьої групи (ізогемаглютинін α) вказує на наявність антигена А, отже кров належить до групи А(II); в) аглютинація в краплях з сироватками першої і другої групи вказує на наявність в крові антигена В і кров належить до групи В(III); г) якщо аглютинація настала у всіх трьох групах, кров містить антигени А і В, тобто належить до групи АВ (IV), в подібному випадку треба виключити неспецифічну аглютинацію. Для цього таким самим способом досліджують поведінку випробовуваної крові із стандартною сироваткою до групи АВ (IV). Якщо аглютинація не настала, підтверджується група АВ (IV). Якщо аглютинація не специфічна, вона з'являється і в цій пробі (табл. 14.1) Таблиця 14.1. Реакція аглютинації при визначенні груп крові методом стандартних сироваток.
При визначенні групи крові подвійною реакцією, крім стандартних сироваток, необхідні і стандартні еритроцити. Останні є 10-20% суспензією еритроцитів групи А(ІІ) і В(ІІІ) в цитратно-фізіологічному розчині. Зберігаються в холодильнику 2-3дні. Для визначення групи крові за стандартними еритроцитами на тарілку (планшет) наносять 2 краплі сироватки, що відстоялася. У першу додають одну краплю стандартних еритроцитів А(ІІ), в другу – В(ІІІ), краплі перемішують і враховують реакцію через 5 хвилин: 1. аглютинація з еритроцитами А(ІІ) і В(ІІІ) вказує на те, що досліджувана сироватка належить до 0(І) групи крові – в ній містяться аглютиніни α та β; 2. відсутність аглютинації з еритроцитами А(ІІ) і В(ІІІ) вказує на належність досліджуваної сироватки до групи АВ|(IV) – в ній відсутні аглютиніни |; 3. аглютинація з еритроцитами В(ІІІ) вказує на належність досліджуваної сироватки до групи А(ІІ) – в ній присутні аглютиніни β. 4. аглютинація з еритроцитами А(ІІ) вказуєна належність досліджуваної сироватки до групи В(ІІІ) – в ній присутні аглютиніни α. Рекомендується визначати групу крові на одній тарілці по стандартних сироватках і стандартних еритроцитах одночасно. Труднощі при визначенні груп крові пов'язані з: 1. неакуратним поводженням з піпетками; 2. низьким титром стандартних сироваток; 3. неправильним співвідношенням сироватки і крові; 4. засиханням краплі після тривалого стояння; 5. в окремих випадках з'являється панаглютинація– в цьому та іншому сумнівному випадках кров відправляють в спеціалізовану лабораторію.
Кров для визначення резус-фактора беруть у звичайну пробірку в об'ємі 4-5 мл без стабілізатора. Після утворення згустка пробірку струшують для збільшення кількості еритроцитів, що відокремилися. Готують 5-10% суспензію еритроцитів у власній сироватці. На чашку Петрі в 6 точок наносять по 3 краплі протирезусної сироватки двох серій. До першої краплі кожної серії додають 1 краплю суспензії досліджуваних еритроцитів, до другої краплі – контрольні резус-позитивні і до 3 краплі – контрольні резус-негативні еритроцити. Краплі перемішують і чашку Петрі поміщають у водяну баню на 10 хвилин при 45-47°С. Еритроцити, що дали аглютинацію з протирезусною |сироваткою, є резус-позитивними |. Помилки при визначенні резус-приналежності: недооблік групової належності крові і титру сироватки антирезус, неправильне співвідношення компонентів, неправильна температура бані, недостатній час обліку (10 хвилин), використання прострочених сироваток. Останніми роками для визначення груп крові і приналежності резусу все ширше використовуються моноклональні тест-реагенти Анти-А, Анти-В| і анти-D. Діючим елементом цього теста-системи є специфічні моноклональні IgM антитіла до відповідних антигенів еритроцитів людини, які викликають аглютинацію еритроцитів. Тест-реагенти Анти-А і Анти-В викликають пряму аглютинацію еритроцитів, які мають групоспецифічні антигени (за системою АВ0) відповідно А і В. Тест-реагенти не містять антитіл іншої специфічності, і тому не викликають неспецифічну поліаглютинацію еритроцитів. Вони не є продуктами клітин людини, тому виключена контамінація препаратів вірусами гепатиту і СНІДу. Моноклональні тест-системи є надійними, реакція відбувається швидше і виразно, порівняно із стандартними сироватками. Для визначення групи крові на тарілку (планшет) наносять по 1 краплі (приблизно 0, 1 мл) тест-реагенту Анти-А і Анти-В. Поряд з краплями антитіл наносять по одній маленькій краплі (приблизно 0, 01 мл) досліджуваної крові (або еритроцитів). Антитіла і кров змішують ретельно сухою скляною паличкою. Спостерігають за ходом реакції при легкому помішуванні планшета протягом 3 хвилин (табл. 14.2)
Таблиця 14.2. Реакція аглютинації при визначенні груп крові методом моноклонального тест-системи
Тест-реагенти анти-D призначені для визначення резус-приналежності крові людини шляхом визначення на еритроцитах людини за допомогою реакції прямої гемаглютинації D-антигена. Для визначення приналежності резусу на планшет наноситься крапля приблизно 0, 1 мл) тест-реагенту анти-D. Поряд поміщають маленьку краплю (0, 01 мл) досліджуваної крові та змішують скляною паличкою з реагентом тесту. Реакція аглютинації починає розвиватися через 30 секунд при слабкому похитуванні планшета, чітко виражена аглютинація настає через 60 секунд. Проте урахування результатів реакції слід проводити через 5 хвилин, оскільки з еритроцитами, які несуть слабкий D-антиген, реакція розвивається повільніше. У разі негативної реакції у донорів слід перевірити кров в реакції з желатином тим самим антигеном тесту. Для цього в пробірку вносять одну краплю (0, 1 мл) суспензії досліджуваних еритроцитів. Потім додають 2 краплі (0, 2 мл) 10% розчину желатину, заздалегідь підігрітого при 45-50°С до розчинення і одну краплю (0, 1 мл) тест-реагенту анти-D. Суміш ретельно перемішують, інкубують 10 хвилин на водяній бані або 30 хвилин в термостаті при 48° С, додають фізіологічний розчин до блідо-рожевого забарвлення розчину. Наявність аглютинації визначають візуально після акуратного повернення пробірки. Аглютинація еритроцитів свідчить про наявність в них D-антигена.
|
