Занятие № 10

Культура клеток – это клетки многоклеточных организмов (человека, животных), живущие и размножающиеся in vitro. Подразделяются на:

Ø первичные (неперевиваемые);

Ø полуперевиваемые;

Ø перевиваемые.

Первичные (неперевиваемые) культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов и тканей организма (почек, легких, кожи, тимуса, тестикул эмбриона человека или молодых животных).

Этапы приготовления первичных культур клеток:

Ø выделение органа/ткани;

Ø измельчение и гомогенизация ткани до частиц размером 2-4 мм;

Ø разъединение клеток путем трипсинизации;

Ø внесение в пробирку (флакон, матрас) с питательной средой (среда 199, Игла);

Ø инкубирование в термостате – клетки начинают делиться до покрытия поверхности стекла в один слой и прекращают размножаться (контактное торможение).

Первичные культуры клеток живут ≈ 7-21 день, при пересевах меняют форму и гибнут.

Полуперевиваемые культуры клеток – диплоидные клетки человека, выдерживающие до 50-100 пассажей (после перевивания в новую пробирку со свежей питательной средой вновь начинают размножаться до образования монослоя).

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время (злокачественные/опухолевые клетки с гаплоидным набором хромосом, выдерживающие бесконечное количество пассажей): например, HeLa – клетки рака шейки матки (получены от женщины, умершей в 1956 г.), Нep-2 – клетки карциномы гортани и др.

Методы индикации вируса в культуре клеток:

1) цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клетки – дегенеративные морфологические изменения клеток (мелкозернистое перерождение, округление, фрагментация, образование симпластов);

2) образование вирусом специфических внутриклеточных включений;

3) бляшкообразование (феномен Дальбекко) – образование в монослое клеток «стерильных пятен» (бляшек – деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться красителем нейтральным красным (количество бляшек соответствует количеству вирусных частиц);

4) цветная проба Солка – сохранение первоначального цвета среды (красного) при наличии вируса, тогда как активные незараженные вирусом клетки метаболизируют и изменяют цвет среды (желтый);

5) РГА с культуральной жидкостью;

6) реакция гемадсорбции (РГадс) – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженной вирусом клетки;

7) феномен интерференции (используется для обнаружения вирусов, не оказывающих ЦПД и не вызывающих гемагглютинацию) – в зараженную материалом культуру клеток вносят индикаторный вирус (ВВС – вирус везикулярного стоматита) с известным ЦПД (симпластобразование) – при наличии в культуре клеток исследуемого вируса индикаторный вирус ЦПД не окажет (клетка может поражаться только одним вирусом).

Достоинства – получение максимальной концентрации вируса.

Недостатки – не все вирусы культивируются в культуре клеток.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ДЛЯ ОБУЧАЮЩИХСЯ

по дисциплине «микробиология»

для специальности 060301 – Фармация (очная форма обучения)

 

К ЛАБОРАТОРНОМУ ЗАНЯТИЮ № 10

Тема: «Методы культивирования вирусов. Бактериофаги»

Утверждены на кафедральном заседании

протокол № ____ от «___»____________ 20__ г.

 

Заведующая кафедрой микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича

к.б.н., доц. ___________________Перьянова О.В.

 

Составители:

к.б.н., доц. ___________________Перьянова О.В.

ст. препод. ___________________Подгрушная Т.С.

 

 

Красноярск

Занятие № 10

Тема: «Методы культивирования вирусов. Бактериофаги»

2. Форма организации занятия: лабораторное занятие

3. Значение изучения темы

Лекарственно-устойчивые микроорганизмы возникли и стали развиваться после внедрения химиопрепаратов и антибиотиков в клиническую практику. Этот процесс наблюдается не только среди патогенных, но и условно- патогенных форм микроорганизмов. Последние часто становятся причиной осложнения, вплоть до тяжелых форм гнойно-септических заболеваний. Поэтому весьма актуально использование уже имеющихся и конструирование новых препаратов бактериофагов. В отличие от химиотерапевтических средств фаги действуют избирательно на клетки определенного вида, не затрагивают представителей нормальной микрофлоры и безвредны для человеческого организма. При создании препаратов бактериофагов необходимо обеспечивать их широкую валентность - полноту лизируемости циркулирующих штаммов.

Расширение путей введения фагов а организм требует разработки безбелковых безаллергенных сред для их приготовления, особенно в случае введения фагов детям грудного возраста, а также страдающим диатезами и другими аллергическими заболеваниями.

Неотложной задачей является расширение номенклатуры бактериофагов в соответствии со структурой гнойно-септических заболеваний - фаги к клебсиеллам, цитробактериям, провиденциям, гафниям, расширение валентности стафилококкового фага с включением рас, активных не только к золотистым, но и эпидермальным стафилококкам.

4. Цели обучения:

- - общая (обучающийся должен обладать ОК и ПК):

- способностью и готовностью к формированию системного подхода к анализу медицинской информации, опираясь на всеобъемлющие принципы доказательной медицины, основанной на поиске решений с использованием теоретических знаний и практических умений в целях совершенствования профессиональной деятельности (ПК-3);

- учебная:ознакомиться с практическим использованием бактериофагов в медицине и микробиологии

на основе теоретических знаний и практических умений обучающийся должен:

знать:

1. Умеренные и вирулентные бактериофаги, особенности их взаимодействия с клеткой

хозяина.

2. Практическое использование бактериофагов в микробиологии и медицине.

уметь

1Установить феномен бактериофагии на плотных и жидких питательных средах,

2.Оценить полученные результаты.

5. План изучения темы: