Хроматографические методы, применяемые на стадии тонкой очистки

После стадии концентрирования получается продукт или сырец, содержа­щий 50—80% целевого вещества. На заключительных стадиях выделения и очистки применяют различные Хроматографические методы.

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматогра­фии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и фор­мой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии использу­ются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), попе­речно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выра­женными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (СЬ-агарозы и сефакрилы-8), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Сте­пень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способ­ности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вещества в порядке убывания их молекулярных масс, т. е. гель выполняет роль молекулярного сита. Этот способ особенно эффективен на заключительных стадиях выделения и очистки ве­ществ.

Аффинная хроматография. Данный метод заключается в использовании иммобилизованного на матрице специфического соединения — лиганда, спо­собного специфически и обратимо связываться только с белками и фермента­ми, имеющими сродство к данному лиганду. В аффинной хроматографии ис­пользуют различные нерастворимые сорбенты. Так, все большее распростра­нение получают поперечно-сшитые гранулы агарозы.

Иммуноадсорбция. Абсолютно специфическим адсорбентом для любого фермента или белка является антитело к этому белку, которое связано с нера­створимой матрицей. Антитела обладают высокой избирательностью только к тем белкам, против которых они были получены. Поэтому при использовании иммуноадсорбентов можно получить препараты фермента более чистые, чем при использовании на других типах аффинных адсорбентов.

Фронтально-вытеснительный вариант хроматографии. В этом случае используются значительные изменения коэффициентов распределения и эф­фективных коэффициентов диффузии целевого вещества при «малых» изме­нениях физико-химических свойств элюирующего раствора.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Этот вид хроматографии является важнейшим методом анализа и препаративного раз­деления биологически активных веществ. ВЭЖХ — это современная форма реализации классической хроматографии колоночного типа; она отличается возможностью выделять высокоочищенные вещества из сложной смеси, вклю­чающие в том числе и близкие по свойствам компоненты. При этом в рамках одного хроматографического эксперимента можно получить ряд высокоочи­щенных или индивидуальных компонентов.

К преимуществам ВЭЖХ относятся:

• высокая скорость процесса, позволяющая сократить продолжитель­ность разделения от нескольких суток до минут;

• минимальная степень размывания хроматографических зон, что дает возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции;

• высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработки информации, благодаря чему колоночная жидкостная хроматография достиг­ла нового уровня воспроизводимости и точности.

К недостаткам метода ВЭЖХ, резко ограничивающим возможности его широкого использования, следует отнести дороговизну процессов, протекаю­щих при повышенном давлении с использованием микрогранульных сорбен­тов, а следовательно, и высокой стоимости продуктов. Кроме того, основопо­лагающие принципы ВЭЖХ затрудняют масштабирование процесса, что так­же ограничивает области применения ВЭЖХ.

Существуют различные варианты ВЭЖХ.

Нормально-фазовая хроматография. При данном варианте ВЭЖХ подвиж­ная фаза менее полярна, чем неподвижная, и основной фактор, определяю­щий удерживание, — это взаимодействие сорбатов непосредственно с поверх­ностью либо с внутренним объемом сорбента.

Обращенно-фазовая хроматография. При этом варианте ВЭЖХ подвижная раза более полярна, чем неподвижная, и удерживание определяется непосред­ственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента: при этом ионизированные сорбаты не обмениваются на ионы подвижной фа­зы, сорбированные — на поверхности.

Ионообменная хроматография. При ионообменной хроматографии сорб­ция осуществляется путем обмена сорбированных ионов подвижной фазы на ноны хроматографируемых веществ. Аналогичным образом можно определить лигандообменную хроматографию.

Хроматография на динамически модифицированных сорбентах. Это вариант ВЭЖХ, при котором сорбат не взаимодействует непосредственно с поверхно­стью сорбента, а вступает в ассоциацию с молекулами поверхностных слоев элюента. Состав этих слоев, находящихся в динамическом равновесии с под­вижной фазой, отличается от среднего для данного эксперимента состава под­вижной фазы.

Ион-парная хроматография. Это такой вариант обращенно-фазовой хро­матографии ионизированных соединений, при котором в подвижную фазу до­бавляется гидрофобный противоион, качественно изменяющий сорбционные характеристики системы.

Эксклюзионная хроматография. Это способ разделения соединений по их молекулярным массам, основанный на различии в скорости диффузии в порах неподвижной фазы молекул различных размеров.

Рассмотрим подробно наиболее распространенные виды ВЭЖХ.

В настоящее время из всех вариантов ВЭЖХ наиболее широко применяет­ся обращенно-фазовая. Ее преимущество определяется методической просто­той и универсальностью, во многих случаях — простотой механизма сорбции.

Термин обращенно-фазовая хроматография ввел А. Мартин в 1950 г. В от­личие от других, ранее применявшихся систем распределительной хромато­графии, здесь неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, что, собст­венно, и послужило поводом к такому названию.

Основными достижениями современной обращенно-фазовой ВЭЖХ как метода разделения белков является разработка неподвижных фаз с большим размером пор (больше 10 нм). Эти фазы обладают большой селективностью и обеспечивают большой выход продукта. Отличные хроматограммы получены на неподвижной фазе на основе силикагеля с порами размером 33 нм. На этих колонках были разделены такие высокомолекулярные белки, как коллаген, сывороточный альбумин, овальбумин, цепи фибриногена, молекулярная мас­са большинства соединений составляла от 40 до 300 кОа. Выход белкового компонента достигал 85%.