Лабораторная диагностика чумы у носителей и переносчиков7.2.1. Общие положения. Диагностические исследования материала на чуму проводят в бактериологических лабораториях противочумных учреждений (противочумные институты, станции, отделения), в специальных или приспособленных помещениях сезонных эпидотрядов, в подвижных автолабораториях, в вагонах-лабораториях, в палатках, юртах и т.д. Во всех случаях планировка должна обеспечить необходимый набор помещений и поточность прохождения материала. Каждая лаборатория должна иметь разрешение на диагностические исследования на чуму в соответствии с действующими правилами по биологической безопасности работы. Лабораторное исследование носителей и переносчиков на зараженность их чумой проводят специалисты противочумных учреждений с высшим и средним медицинским и биологическим образованием, подготовленные на соответствующих курсах специализации и имеющие свидетельства об их окончании. Все исследования осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по безопасности работы с микроорганизмами I-II группы патогенности. Исследованию в природных очагах чумы подлежат: грызуны, зайцеобразные, насекомоядные и наземные хищники, их эктопаразиты; трупы мелких млекопитающих, остатки пищи из гнезд хищных птиц, материал от больных и павших верблюдов, эктопаразиты, снятые с верблюдов и других домашних животных. В отдельных случаях исследуют материал от сайгаков, погадки хищных птиц, экскременты грызунов и хищников, пробы почвы. Полевой материал необходимо доставлять в лабораторию в предельно короткие сроки, предпочтительнее в первой половине дня, с целью исследования его в течение первых суток. Полевой материал в лабораториях ПЧС необходимо исследовать дифференцированно. Тактические и методические приемы лабораторных исследований полевого материала должны определяться их информативностью в различные фенологические периоды жизнедеятельности носителей и переносчиков чумы в зависимости от характера и качества доставленного материала. Животных, добытых живыми, если не предполагаются специальные исследования, умерщвляют прямо у капкана с помощью корнцанга. Трупы помещают в бязевые мешочки, которые плотно завязывают, снабжают этикетками, складывают в металлические отсадники, ящики или клеенчатые мешки и по возможности быстро доставляют в лабораторию. Если необходимо кратковременное хранение материала, то это осуществляют в относительно прохладном месте (в специально вырытой яме, расщелине и т.д.). Живых грызунов помещают в отсадники, металлические ящики или ящики, обитые изнутри жестью, и обрабатывают инсектицидами. Ящики должны быть снабжены решетчатой крышкой. Лабораторное исследование полевого материала начинают сразу же после его поступления. При невозможности этого допускается кратковременное его хранение (не более 20 ч) в помещении с низкой температурой (рефрижератор, ледник и др.). Эктопаразитов собирают в стерильные пробирки, закрывают ватно-марлевой пробкой, затем упаковывают в отсадники или металлические пеналы. Эктопаразиты должны быть доставлены в лабораторию живыми или в консервирующей жидкости: раствор хлористого натрия с генцианвиолетом 1:200 000 -1:300 000. Трупы животных после очеса погружают в 3 % мыльный раствор или другое моющее средство, затем помещают на сетку, после того, как раствор стечет, укладывают на вскрывочные доски, группируя по точкам добычи и видам. Вскрытие, посев органов, приготовление суспензий из органов, забор крови, осуществляет лаборант (очес и вскрытие грызунов может проводить дезинфектор). Определение вида, пола, возраста грызуна, его генеративного состояния, оценку патологоанатомических изменений в органах исследуемого зверька, заражение биопробных животных, осуществляют врач-бактериолог и лаборант. Правильность определения вида, пола, возраста и генеративного состояния грызуна контролирует зоолог не реже 2 раз в месяц. Все указанные выше сведения заносят в протокол вскрытия, где отмечают порядковый номер по журналу вскрытия грызунов и номер биопробного животного. Вскрытие проводят без отсепарирования кожи, откидывая кожно-мышечный лоскут на мордочку животного. Исследование материала проводят бактериологическим, серологическим, биологическим и молекулярно-генетическими методами. 7.2.2. Бактериологический метод исследования носителей чумы. До обнаружения эпизоотии на данной территории у всех зверьков подлежат исследованию печень и селезенка. Суспензии готовят из органов зверьков одного вида, добытых в одной точке обследования. Для одной суспензии объединяют органы не более чем от 10 мелких зверьков, от 5 сравнительно крупных (сурки, хори и т.д.). Кусочки органов тщательно растирают в ступке со стерильным песком, затем добавляют небольшое количество 0,9 % раствора хлористого натрия (не более 2 мл). Полученную суспензию используют для посева на плотные питательные среды, нанося каплю суспензии у края чашки и рассевая её затем по всей поверхности петлей частыми штрихами. Этой же суспензией заражают биопробное животное. После обеззараживания суспензия может быть использована для поиска антигена. При выделении первой культуры, в зависимости от задач эпизоотологического обследования, посев органов может производиться отпечатками их срезов на агаровые пластинки. На одну чашку агара может быть посеян материал от 3 животных, если исследуют только печень и селезенку, или от 2 животных, если исследованию подлежит и кровь из сердца (при определении границ эпизоотии). Оптимальным является дублирование посевов: отпечатками органов и посев их суспензий. Объекты с посевами инкубируют при 28° С. Просмотр осуществляют через 24-48 ч и далее ежедневно до 5 сут. от момента посева. При обнаружении характерных для чумы патологоанатомических изменений у животных кроме печени, селезенки обязательно исследуют кровь, легкие и лимфатические узлы (паховые, аксилярные, глоточные, паратрахеальные, забрюшинные), участки измененных органов и тканей. Из всех органов делают мазки-отпечатки, красят их анилиновыми красками и просматривают под микроскопом. Органы от каждого животного сеют отпечатками на пластинки агара, затем собирают в ступку со стерильным песком и готовят суспензию, которую засевают на агар. Этой же суспензией заражают индивидуальную биопробу. Остальной материал после обеззараживания используют для серологического исследования, направленного на поиск специфических для чумы антигенов (РНГА-РНАт), а также для выявления ДНК возбудителя чумы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суспензии сгустков крови сердца и крупных сосудов после инактивации исследуют серологически на наличие специфических антител (РПГА-РНАг). Трупы животных, найденных в поле, исследуют так же, как зверьков с патологоанатомическими изменениями. Помимо этого у них обязательно исследуют костный или головной мозг посевом на отдельную чашку, суспензией головного или костного мозга заражают вторую индивидуальную биопробу. Для посевов используют селективные питательные среды с ингибиторами роста посторонней флоры. Труп павшего верблюда, как правило, вскрывает ветеринарный работник под наблюдением специалиста противочумного учреждения или специалиста по особо опасным инфекциям ЦГиЭ с соблюдением правил биологической безопасности. Для исследования забирают лимфатические узлы глоточного кольца, шейные, брыжеечные и забрюшинные, паховые, аксилярные, кусочки паренхиматозных органов, легких, надпочечников, сгустки крови из сердца и крупных сосудов, участки патологически измененных тканей и органов, костный мозг из трубчатой кости. Материал подлежит бактериологическому, биологическому, серологическому и молекулярно-генетическому исследованию. Каждый орган сеют на отдельную чашку Петри с селективной средой (в качестве ингибитора предпочтительнее фосфомицин – 100 мкг/мл, губительно действующий на вульгарный протей). Суспензией органов заражают не менее 2 биопробных животных (подкожно и накожно) и 1 биопробное животное заражают суспензией костного мозга. После обеззараживания суспензия органов исследуется серологически (поиск антигена), а также для выявления ДНК возбудителя чумы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сыворотку, полученную после сокращения сгустков крови, подвергают инактивации и адсорбции, после чего исследуют серологически для поиска специфических антител. 7.2.3. Бактериологический метод исследования переносчиков чумы. Определение видового состава или систематической принадлежности эктопаразитов и формирование посевов проводится паразитологом или специально подготовленным лаборантом. Сборы блох с каждого грызуна или одной норы исследуют отдельно групповым способом, взяв на один посев, как правило, не более 20-30 насекомых. При обилии блох разрешается доводить количество их в одном посеве до 50. Допускается объединять в одну пробу блох с носителей одного вида с одного участка или из близлежащих гнезд. Индивидуальному исследованию в обязательном порядке подлежат все эктопаразиты, собранные с трупов животных или животных с патологоанатомическими изменениями, характерными при чуме, а также с целью определения процента зараженности блох. Блох перед исследованием усыпляют эфиром, без предварительной промывки ссыпают в стерильную ступку, куда вносят 0,5 мл 0,9 % раствора хлористого натрия или чумной антифаговой сыворотки. После растирания делают посев на агаровые пластинки. При исследовании на чуму иксодовых клещей в один посев берут не более трех пивших самок, голодных – до 30, пивших нимф – до 15, голодных – до 50, пивших личинок – до 30 экземпляров. Перед исследованием рекомендуется промывать клещей в 50-70° спирте, а затем в 2-3 порциях 0,9 % раствора хлористого натрия. При растирании напившихся клещей ступку прикрывают крышкой от чашки Петри, напившихся самок перед растиранием разрезают ножницами. Полученную суспензию высевают на питательный агар. В отдельных случаях эту суспензию используют для заражения биопробных животных. 7.2.4. Питательные среды для выделения чумного микроба. Для выделения чумного микроба используют слабощелочной (рН 7,0-7,2) питательный агар с аминным азотом 60-120 мг %. Для диагностических целей могут быть использованы среды лабораторного изготовления, а также коммерческие сухие среды, имеющие номер госрегистрации. Каждая серия агара должна быть проверена на чувствительность к росту чумного микроба согласно действующим нормативно-методическим документам. Срок хранения агара не более 2 месяцев, после чего он должен проходить переконтроль для продления срока годности еще на 1 месяц. Питательные среды должны храниться в темном месте при постоянной температуре (от 4 до 20° С). Перепады температуры снижают качество питательных сред. При диагностике чумы используют селективные среды, которые содержат стимуляторы роста чумного микроба и ингибиторы посторонней флоры. В качестве стимуляторов роста чумного микроба используют сульфит натрия в концентрации 1:4000 (1 мл 2,5 % раствора на 100 мл агара), гемолизированную кровь в концентрации 0,01-1 %, согласно инструкции по применению препарата. В очагах, где циркулируют тиаминзависимые штаммы, в качестве стимулятора роста используют витамин В1 в концентрации 0,0001 мг на 100 мл среды или синтетическую среду 199 (3 мл на 100 мл среды). Для подавления роста посторонней микрофлоры используют генцианвиолет в концентрации 1:100000 - 1:800000. Рабочую дозу определяют для каждой серии препарата перед обследовательским сезоном и указывают в паспорте на рабочий раствор генцианвиолета. Помимо этого, для ингибирования посторонней флоры могут быть использованы теллурит калия в концентрации 1:300000, дезоксихолат натрия - 1 мг %, фосфомицин 50-100 мкг/мл. 7.2.5. Биологический метод исследования грызунов. В качестве биопробных животных могут быть использованы белые мыши и морские свинки. Способ приготовления суспензий для биопроб описан выше. Заражают биопробных животных подкожно в паховую область; белым мышам вводят 0,5 мл суспензии, морским свинкам –1,0 мл. При исследовании сильно загрязненного материала (загнившие трупы, субстраты нор, помет) заражают биопробных животных накожно. Павших биопробных животных исследуют, проводя вскрытие по полной схеме (отсепаровка кожи, осмотр и посев лимфоузлов, посев всех органов, крови, серологическое исследование на наличие антигена). От павшей биопробы обязательно ставят пассажи до выяснения причины гибели. После обеззараживания суспензия органов павшей биопробы может быть исследована в ПЦР. Биопробных животных, выживших после заражения, забивают через 6 сут. также с полным бактериологическим исследованием без пассажа. При исследовании материала из сочетанных природных очагов чумы и туляремии биопробных животных забивают на 8-9-е сутки. 7.2.6. Идентификация выделенных культур чумного микроба. Первичная (предварительная) идентификация выделенной культуры проводится сразу после ее выделения по следующим признакам: - морфология роста на питательном агаре и бульоне; - морфология клетки, характер окраски по Граму; - лизис диагностическими бактериофагами Л-413С, Покровской; - подвижность в 0,4 % агаре - ферментация мочевины (при отсутствии ЦДС), рамнозы, глицерина; - характерный рост на среде ЦДС (отсутствие способности к ферментации мочевины и лактозы); - чувствительность к антибиотикам методом дисков (при выделении первой культуры). Окончательная идентификация и изучение культуры чумного микроба проводится в стационарной лаборатории противочумной станции или института, имеющих разрешение на проведение работы с возбудителями I группы патогенности по следующим признакам: - наличие Ф1; - биохимическая активность (пестрый ряд), подвижность; - вирулентность для лабораторных животных и in vitro - плазмидный состав (pCad, pPst, pFra); - способность к нитрификации и денитрификации; - пестицин-фибринолизин-плазмокоагулазная активность; - чувствительность к пестицину 1; - питательная потребность при необходимости. 7.2.7. Серологический метод исследования полевого материала. Серологические реакции направлены на поиск антител к специфическому антигену FI в сыворотке крови у носителей чумы, наземных хищников, домашних животных и антигена в тканях и органах зверьков с патологоанатомическими изменениями, их трупов, в субстратах нор теплокровных, остатках пищи и погадках хищных птиц, субстратах гнезд, в помете носителей, почве. При выполнении серологических исследований должны быть соблюдены следующие правила: - серологические реакции должны ставить только с обеззараженным материалом; - все иммунобиологические и диагностические препараты должны иметь номера госрегистрации; - планшеты, пипетки, капельницы, шприцы должны быть вымыты моющим средством, хорошо отмыты обильным количеством воды, последнее ополаскивание проводят дистиллированной водой; луночки планшетов должны быть гладкими и прозрачными; - сыворотки человека и животных (верблюда, кошек, собак), а также мутные сыворотки и с признаками гемолиза необходимо перед исследованием адсорбировать 50 % взвесью формалинизированных, но не сенсибилизированных эритроцитов; - все ингредиенты для серологических реакций должны быть оттитрованы (не реже 1 раза в 2 недели), формалин перед обследовательским сезоном адсорбирован мелом (1:1) для инактивации кислых продуктов в коммерческом препарате, растворы формалина и мертиолята натрия проверены на антибактериальную активность; - все исследования проводят согласно действующим инструктивно-методическим материалам по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. Для поиска антител исследуют сыворотки, смывы из сердца и крупных сосудов или высушенные на фильтровальных бумажках образцы крови и сыворотки животных. Поиск антител осуществляют у зверьков, относительно резистентных к чумному микробу (малый, длиннохвостый, горный, даурский суслики, полуденная песчанка с левого берега Волги, даурская пищуха, мелкие куньи и др.). Для обнаружения антител используют реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с антигенным диагностикумом, а также реакцию нейтрализации антигена с иммуноглобулиновым диагностикумом. При массовых исследованиях реакции ставят в два этапа: вначале каждая из реакций в двух луночках и только при положительных результатах ставят развернутые реакции для определения их титра. Система однонаправленных реакций весьма информативна, т.к. по соотношению титров двух реакций (превышение титра РНАг) можно судить о давности контакта зверька с микробом, а при достаточно большом количестве исследований о фазе эпизоотии в данном участке территории. С этой же целью ставят пробу с восстановителем 2-меркаптэтанолом (СН2ОНСН23Н), которая дифференцирует макро- и микроглобулины. При сомнительных результатах реакции повторяют после адсорбции исследуемого материала 50 % взвесью формалинизированных, но несенсибилизированных эритроцитов, параллельно ставят идентичные реакции с гетерологичными диагностикумами (туляремийный, бруцеллёзный, холерный и др.). Для поиска антигена готовят суспензии из исследуемого материала, добавляя к нему 0,9 % раствор хлористого натрия с 2 % формалина. На 1 часть субстрата добавляют 10 частей раствора. После отстаивания в течение не менее 3 ч (лучше 20-24 ч) отбирают надосадочную жидкость и ставят серологические реакции: РНГА и РТНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом и реакцию нейтрализации антител (РНАт) с антигенным диагностикумом. С целью подтверждения специфичности результатов следует тот же материал использовать в системе серологических реакций (РНГА-РНАт) с гетерологичными диагностикумами (туляремийный, бруцеллезный, холерный и др.). Тактика применения иммуноферментного анализа для поиска антигена FI и антител к нему такая же, как при использовании иммуносуспензионных методов. 7.2.8. Молекулярно-генетический метод исследования полевого материала Полимеразная цепная реакция используется при углубленном эпизоотологическом обследовании территории (преимущественно в пунктах долговременного наблюдения). Исследованию подлежат суспензии органов носителей чумы с характерными патологоанатомическими изменениями, трупов павших зверьков, трупов верблюдов, а также при необходимости суспензии эктопаразитов, субстраты гнезд грызунов, погадки и остатки пищи хищных птиц, пробы почвы и др. Для проведения генодиагностического анализа применяют "Тест-систему для выявления ДНК Y. pestis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)" производства ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб", г. Саратов. Выделение ДНК, проведение ПЦР и учет результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению тест-системы. Предварительно исследуемый материал обеззараживают. К подготовленным суспензиям добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 и прогревают при 56 оС в течение 30 мин. Далее 0,1 мл пробы переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор на основе 6М гуанидинтиоцианата в объеме, указанном в инструкции к тест-системе, и инкубируют в течение 15 мин при температуре 65 оС. ПЦР может быть использована как при исследовании биологического материала и объектов окружающей среды, так и для характеристики плазмидного профиля штаммов возбудителя чумы, его вирулентности, при идентификации и типировании выделенных культур.
|
