У сфері авторського права

Дата добавления: 2015-09-18; просмотров: 873

Одной из главных проблем современной медицины является лечение

такого заболевания, как туберкулез. Туберкулез сегодня – это пандемия,

распространяющаяся по планете с катастрофической скоростью, треть

населения мира инфицировано микобактериями туберкулеза [20, c.8]. Поэтому

проблема создания терапевтической системы, позволяющей осуществить

направленный транспорт лекарства в место назначения в заданные сроки,

особенно важна в химиотерапии туберкулеза, лечение которого требует

многократного введения лекарства в организм в течение суток. Несмотря на

широкий спектр существующих противотуберкулезных препаратов

комбинации различных лекарственных средств (отличающихся по структуре и

механизмам действия), используемых при интенсивном лечении, оказывают

значительное токсическое действие на организм в целом и приводят к развитию

множественной лекарственной устойчивости.

Так как большинство

противотуберкулезных препаратов имеют белковую структуру, их период

полувыведения обычно очень короткий (п-аминосалициловая кислота – 45-60

мин, Амикацин – 2-3 ч., Стрептомицин – 5-6 ч. и Капреомицина сульфат – от 3-

х до 6-ти часов), т.е. они быстро выводятся из организма, следовательно, такие

лекарства необходимо вводить парентерально не менее 2-х раз в день. Также, в

связи с достаточно быстрым метаболизмом в организме большинства

современных противотуберкулезных препаратов, только небольшая их часть

оказывает полезное действие. Поэтому необходимы новые подходы для

решения этой проблемы.

Внимание ученых в настоящее время

сконцентрировано на повышении эффективности действия существующих

противотуберкулезных препаратов созданием полимерных систем лекарств

(полимерных наночастиц [15, c.3; 16, c.342; 17, c.15; 18, c.8; 136, c.3], липосом

и/или везикул, наполненных лекарством [137], аэрозольных частиц для прямого

введения в легкие человека [138], а также лекарственных форм в виде гранул

[139]). Заслуживает внимания, на наш взгляд, разработка новых форм для

транспорта противотуберкулезных препаратов в виде полимерных наночастиц

и нанокапсул, которая позволила бы обеспечить пролонгированное

высвобождение лекарства поддержанием эффективной концентрации

лекарственного вещества в крови в течение заданного промежутка времени,

снизила бы побочные действия лекарственного препарата, таким образом

повышая его терапевтический эффект [3, c.160; 34, c.686; 140, c.441]. В связи с

этим, нашей задачей было исследование возможности получения наночастиц

противотуберкулезных и противоопухолевых препаратов на основе природных

и синтетических полимеров.

Из литературных источников известно, что наночастицы получают как из

природных (альбумин, желатин, декстран и др.), так и из синтетических

(полиметилметакрилат, полистирол, полиметилцианоакрилат,

полибутилцианоакрилат, полиизобутилцианоакрилат и др.) полимеров [15, c.4].

В настоящей работе в качестве лекарственных средств для связывания с

полимером использованы препараты, наиболее часто используемые в терапии

туберкулеза: п-аминосалициловая кислота, Стрептомицин, Капреомицина

сульфат. Химические формулы противотуберкулезных препаратов,

использованных в данной работе, приведены на рисунке 4.

(а)

(б)

H2N

OH

(в)

COOH

(а) - Капреомицина сульфат; (б) - п-аминосалициловая кислота; (в) –

Стрептомицин

Рисунок 4 - Структурная формула лекарств

Первым антибиотиком из класса аминогликозидов и первым

лекарственным препаратом, применяемым в борьбе с туберкулезом, является

стрептомицин, который и на сегодняшний день имеет широкое применение в

лечении туберкулеза. Наряду с ним широко используется п-аминосалициловая

кислота с ее натриевой солью и является одним из первых антибиотиков,

используемых в терапии туберкулеза.

Противотуберкулезный препарат капреомицина сульфат используется в

случае, когда противотуберкулезные препараты 1-го ряда неэффективны или не

могут применяться из-за токсического действия или присутствия устойчивых

туберкулезных бацилл.

Эти лекарства, хотя и обладают высоким туберкулостатическим действием,

имеют ряд побочных эффектов, а также требуют частого приема. Кроме того,

все вышеперечисленные препараты за исключением п-аминосалициловой

кислоты, не всасываются желудочно-кишечным трактом, поэтому

предполагают только инъекционный способ (внутривенно или внутримышечно)

55

введения в организм. Разработка наносомальных форм противотуберкулезных

препаратов на полимерной основе позволило бы создать систему доставки

лекарств для инъекционного применения с пролонгированным действием.

С целью создания таких транспортных систем нами осуществлена

эмульсионная полимеризация ряда маслоподобных мономеров в присутствии

лекарственных препаратов.

При получении наночастиц, иммобилизованных лекарственным

препаратом, введение лекарственного вещества непосредственно в

реакционную среду способствует увеличению содержания лекарства в

наночастицах, однако необходимо учитывать ряд проблем, возникающих при

этом, например, влияние лекарства на стабильность эмульсии, его

совместимость с компонентами системы и др. В целях проверки данного

предположения проведена эмульсионная полимеризация стирола в качестве

модельного мономера, в присутствии индифферентного в биологической среде

инициатора - персульфата калия и стабилизатора, широко используемого при

получении полимерных наночастиц - додецилсульфата натрия.

Нами проведен эксперимент с использованием вышеназванных

компонентов в присутствии лекарственного препарата – п-аминосалициловой

кислоты. Установлено, что присутствие

п-аминосалициловой кислоты

деструктивно влияет на процесс радикальной полимеризации стирола в

эмульсии [141]. Эмульсионная полимеризация в присутствии

п-

аминосалициловой кислоты не протекает, что вызвано, по всей видимости,

разрушением эмульсии полярным лекарственным препаратом, содержащим

положительный и отрицательный заряды, создающие достаточную ионную

силу раствора или разрушением лекарственного препарата. Так, после

добавления в реакционную среду, содержащую стирол, эмульгатор, инициатор,

лекарства и нагревания смеси до 600С, визуально наблюдалось изменение цвета

раствора от молочно-белого до темно-коричневого. Одной из причин этого

явления может быть деструкция лекарственного препарата при нагревании до

температуры реакции. В связи с этим нами изучена стабильность данного

лекарственного препарата при температуре реакции 600С и к УФ-облучению.

Устойчивость лекарственного препарата к нагреванию контролировали по

изменению характерных полос поглощения лекарства в УФ-области (рисунок

5).

Представленные на рисунке 5 спектральные характеристики

лекарственного препарата до обработки, после нагревания и облучения,

идентичны, что свидетельствует об устойчивости лекарства к нагреванию и

влиянию УФ-света.

На основании полученных результатов следует однозначно утверждать,

что п-аминосалициловая кислота препятствует образованию эмульсии, будучи

полярным лекарственным веществом, разрушая стабильность системы; поэтому

эмульсионная полимеризация в присутствии данного лекарства не протекает.

0.7

0.6

at room temperature

after heating at 60C for 1 hour

After irradiation under UV light for 1 hour

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Wavelength (nm)

Рисунок 5 - УФ-спектр п-аминосалициловой кислоты

В продолжение исследований модельных систем нами проведена

эмульсионная полимеризация стирола в присутствии тех же компонентов

системы, но в присутствии капреомицина сульфата. В результате получены

полимерные наночастицы с удовлетворительными характеристиками (таблица

5).

Таблица 5 – Характеристика пустых и иммобилизованных капреомицина

сульфатом наночастиц полистирола

Более низкое значение размера, полидисперсности иммобилизованных

наночастиц, по всей видимости, связано с компактизацией структур, вызванной

присутствием капреомицина сульфата.

Таким образом, на данном этапе работы показано влияние компонентов

системы на процесс образования эмульсии, а также возможность включения в

полимерные носители лекарственного препарата непосредственно на стадии

синтеза полимерных наночастиц методом цепной полимеризации.

57

3.1.1 Синтез полимерных наночастиц на основе полиэтилцианоакрилата

для транспорта противотуберкулезного препарата капреомицина сульфата

Из числа биодеградируемых синтетических полимеров, служащих основой

для получения наночастиц, особый интерес представляют

полиалкилцианоакрилаты. Использование полиалкилцианоакрилатов в области

медицины началось с хирургических нитей и адгезивов, которые обладают

хорошими рассасывающимися свойствами [66, c.331; 67, c.791; 68, c.648; 69,

c.23; 70,

c.530; 142]. Благодаря биосовместимости и способности к

биодеградации алкилцианоакрилаты и их полимеры продолжают привлекать

внимание ученых и являются объектом интенсивного исследования.

Токсичность и скорость деструкции полиалкилцианоакрилатов уменьшается

по мере увеличения длины цепи алкильного заместителя [15, c.5; 142, 154].

Полиалкилцианоакрилаты также являются уникальными материалами для

создания полимерных носителей лекарственных препаратов в виде наночастиц.

Полиалкилцианоакрилаты как системы доставки лекарств в виде коллоидных

наночастиц впервые были разработаны для лечения раковых заболеваний еще в

начале 80-х годов 20-го столетия [66, c.331; 67, c.791; 68, c.648; 69, c.23; 70,

c.530; 142, 156; 143]. Позднее полиалкилцианоакрилатные наночастицы стали

использоваться для транспорта быстро-распадающихся веществ, таких как

белки и нуклеиновые кислоты [66, c.331; 67, c.791; 68, c.648; 69, c.23; 70, c.535].

Известны примеры включения различных цитостатиков (доксорубицина

гидрохлорид, дактиномицин, даунорубицин и др.), а также антибиотиков

(амикацин, ампициллин, ципрофлоксацин и др.) в матрицу

полиалкилцианоакрилатов с целью повышения терапевтического эффекта

лекарств [74, c.56; 75, c.1444; 76, c.70; 77, c.30; 78, c.59; 79, c.2110; 80, c.109; 81,

c.44].

В лаборатории профессора Й.Кройтера (университет им. Й.Гете, Германия)

в течение ряда лет ведутся исследования по созданию наноносителей. Ими

показано эффективное преодоление гемато-энцефалического барьера

поли(бутилцианоакрилатными) наночастицами, иммобилизованными

лекарственным препаратом доксорубицин [74, c.57].

Таким образом, перспективность применения алкилцианоакрилатов и

полимеров на их основе в качестве носителей для доставки различных

лекарственных веществ подтверждается результатами многочисленных

исследований в этом направлении [66, c.331; 67, c.791; 68, c.648; 69, c.23; 70,

c.535; 74, c.56; 75, c.1444; 76, c.70; 77, c.30; 78, c.59; 79, c.2110; 80, c.109; 81,

c.44]. В настоящей работе в качестве полимерных матриц для разработки

наносомальных форм лекарственных препаратов выбраны

полиалкилцианоакрилаты.

Одним из наиболее широко распространенных способов получения

полимерных наночастиц является эмульсионная полимеризация, поскольку этот

метод дает возможность получить продукт с довольно высоким выходом и

удовлетворительными характеристиками. Метод эмульсионной полимеризации

для алкилцианоакрилатов впервые был внедрен научной группой под

руководством Couvreur P. в 1979 году с целью получения полимерных

наночастиц для направленного транспорта лекарственных препаратов [66,

c.331]. Ранние работы Couvreur P. и его сотрудников были посвящены

исследованию токсичности полиалкилцианоакрилатных

наночастиц и

разработке наносомальных форм противоопухолевых препаратов [51, c.29; 67,

c.791]. Основным преимуществом алкилцианоакрилатов по сравнению с

другими синтетическими носителями является биодеградируемость их

полимеров и простота проведения процесса полимеризации [15, c.6; 66, c.331;

67, c.791; 68, c.648; 69, c.23; 70, c.535].

Наиболее эффективным способом получения полиалкилцианоакрилатных

наночастиц является проведение полимеризации по анионному механизму, так

как этот метод позволяет синтезировать полимер с узким распределением

частиц по размерам с удовлетворительными физико-механическими

характеристиками и не требует специальной аппаратуры [68, c.648; 69, c.23; 70,

c.535; 71, c.3; 72, c.134; 73, c.4375]. Полимеризация алкилцианоакрилата

анионным способом протекает в присутствии слабых оснований (оснований

Льюса) при комнатной температуре. Механизм анионной полимеризации

цианоакрилатов может быть представлен следующей схемой (рисунок 6).

Рисунок 6 - Механизм анионной полимеризации алкилцианоакрилата

Результаты исследований последних лет показали,

что наиболее

эффективными среди алкилцианоакрилатов при создании полимерных

носителей для транспорта лекарственных препаратов являются этил-, бутил-,

изобутил-, гексил-, изогексил- и октилцианоакрилаты, так как полученные на

их основе полимеры обладают удовлетворительными физико-химическими

характеристиками и проявляют хорошее биораспределение [68, c.648; 69, c.23;

70, c.535; 71, c.3; 72, c.134; 73, c.4375]. Также известны примеры использования

сополимеров этил-

и бутилцианоакрилатов [92,

c.5145],

и бутил-

и

октилцианоакрилатов структуры ядро-оболочка для транспорта лекарственных

препаратов [92, c. 5146; 93, c.137]. Нами в качестве мономеров для синтеза

полимерных наночастиц, содержащих лекарственное вещество, выбраны этил-

и бутилцианоакрилаты.

59

Эмульсионную полимеризацию этил-

и бутилцианоакрилатов

осуществляли в присутствии катализатора – триэтиламина, а в качестве

стабилизатора использовали Твин-80 и Твин-85.

При этом скорость полимеризации алкилцианоакрилатов зависит от рН

среды: чем выше рН, тем быстрее реакция, так, в щелочной среде

полимеризация заканчивается в течение нескольких секунд, реакция

неконтролируема и приводит к коагуляции; а поддержание кислой среды дает

возможность получить частицы нанометрических размеров. С целью снижения

скорости реакции эмульсионную полимеризацию этилцианоакрилата

осуществляли в сильнокислой среде, созданную буферным раствором.

Полимеризацию проводили в течение 2-х часов, через определенный

промежуток времени, отбирая пробы для определения физико-химических

характеристик, которые приведены в таблице 6.

Таблица 6

–

Физико-химические характеристики пустых

полиэтилцианоакрилатных наночастиц: Т = 250С, [Э] = 5 % от массы мон., [kat]

= 0,01 %

Экспериментальные данные показывают, что активная фаза формирования

частиц полиалкилцианоакрилата длится 30 минут. По истечении этого времени

размер частиц и молекулярная масса полимера изменяются незначительно, при

этом стабилизируется дисперсность частиц.

Средняя молекулярная масса полиэтилцианоакрилата,

определенная

методом гель-проникающей хроматографии, по окончании реакции составила

2428 (рисунок 7).

60

Молекулярную массу полимера также определяли методом масс-

спектрометрии, результаты которых приведены на рисунке 8. Молекулярные

массы, найденные двумя методами имеют удовлетворительную сходимость.

Рисунок 7 - Результаты гель-проникающей хроматографии

Voyager Spec #1[BP = 190.8, 3506]

190.7641

1182.3626

1307.4209

1557.5537

1682.6150

1807.6755

3506.0

1057.3077

1932.7450

2058.8028

368.3151

932.2391

2183.8641

2308.9306

166.8859

550.5467

807.1894

2433.9946

2559.0650

103.7699

154.7674

122.8246

163.9431

288.9370

303.8767

395.0086

522.5102

557.0641

682.1298

712.1620

962.2618

902.2522

1087.3111

1152.3458

1337.4196

1310.4185

1402.4838

1560.5522

1653.6175

1810.6782

1963.7129

2061.8056

2096.4646

2338.8899

2437.0084

2278.9384

2684.1186

2589.0207

2687.1213

2809.1849

2839.1519

99.0

679.4

1259.8

1840.2

2420.6

3001.0

Mass (m/z)

Рисунок 8 - Масс спектр полиэтилцианоакрилатных наночастиц, лист 1

61

Voyager Spec #1[BP = 1557.5, 40403]

1307.4319

1432.4929

1557.5496

1807.6677

1933.7282

4.0E+4

2058.7913

1182.3747

2183.8517

2308.9171

1057.3168

2433.9797

807.1986

932.2569

2559.0384

2684.0991

2809.1642

1685.6054

1810.6650

2934.2264

3059.2871

1337.4333

1560.5479

1462.4870

1837.6448

2088.7643

2338.8849

3184.3451

3310.3992

962.2673

935.2987

1087.3267

1212.3772

1277.4207

1109.6542 1340.4400

1527.5423

1590.5534

1778.6840

2061.7918

2053.4390

1992.7166

2311.9134

2278.9439

2466.9436

2588.9949

2687.0951

2717.0692

2937.2216

2967.1822

3187.3341

3560.5179

3465.4246

3810.6319

3715.5424

799.0

1439.4

2079.8

2720.2

3360.6

4001.0

Mass (m/z)

Voyager Spec #1[BP = 1557.5, 40403]

1557.5496

1682.6070

1683.6073

4.0E+4

1558.5476

1684.6053

1559.5465

1685.6054

1560.5479

1587.5394

1712.5910

1588.5414

1527.5423

1561.5510

1589.5437

1652.6075

1686.6008

1714.5968

1502.0

1529.5576

1547.6

1567.9574

1590.5534

1593.2

1611.9982

1638.8

1658.0387

1684.4

1700.0616

1715.6048

1730.0

Mass (m/z)

Рисунок 8, лист 2

Низкое значение молекулярной массы полиэтилцианоакрилата, по всей

видимости, связано с высокой скоростью полимеризации этилцианоакрилата,

что привело к образованию короткоцепных полимеров [144]. Анализ масс-

спектра полимера показал, что полученный продукт содержит олигомерные

цепи от димеров (n=307) до октамеров (n=1057), а самая длинная цепь состоит

из 32 мономерных звеньев (n=32).

Для детального изучения морфологии полученных

полиэтилцианоакрилатных наночастиц нами сделаны снимки полимеров на

трансмиссионном (а) и сканирующем (б) электронных микроскопах (рисунок

9).

62

(а)

(б)

Рисунок 9 – Электронно-микроскопические снимки пустых

полиэтилцианоакрилатных наночастиц

Из электронно-микроскопических снимков можно судить о том, что

полученные частицы имеют правильную сферическую форму, размер их

составляет менее 100 нм. Снимки, сделанные на сканирующем электронном

микроскопе показывают, что кроме частиц небольшого размера (≈ 130-160 нм),

имеются и агломераты, диаметром более 500 нм. Образование агломератов

неизбежно, при этом их размер не превышает 1000 нм, поэтому они также

могут служить в качестве носителей, поскольку способны проникать в клетку

посредством фагоцитоза.

Известно немало примеров получения пустых полимерных наночастиц в

эмульсии с их последующей иммобилизацией лекарственным препаратом

методом адсорбции. Недостатком этого метода является низкое содержание

лекарственного вещества в носителе. При проведении процесса анионным

механизмом наиболее эффективным способом включения лекарства в

полимерные наночастицы может быть добавление его в реакционную среду

непосредственно в процессе полимеризации, поскольку в этом случае можно

достичь более высокую степень связывания. При этом надо принимать во

63

внимание, что не все лекарства могут быть использованы в условиях

эмульсионной полимеризации, так как кислотность среды, присутствие других

компонентов могут оказать влияние на стабильность лекарства, тогда как

лекарственное вещество, в свою очередь, также может повлиять на ход

процесса.

Устойчивость лекарственных препаратов исследовалось УФ-

спектроскопически при значениях рН 2,0-2,5, заданных буферными растворами.

Для проведения более полного исследования нами было изучено поведение п-

аминосалициловой кислоты и капреомицина сульфата в кислой, щелочной и

нейтральной средах, результаты которых приведены на рисунке 10.

(1)

(2)

(1) – п-аминосалициловой кислоты, (2) – капреомицина сульфата

раствор лекарства; сильнокислая среда; щелочная среда;

нейтральная среда

Рисунок 10 - УФ-спектры лекарств

Из этих рисунков видно, что капреомицина сульфат не изменяется в

составе в кислой и щелочной средах, тогда как для п-аминосалициловой

кислоты наблюдается изменение в составе в кислой среде с образованием

гидрохлорида. В связи с этим, для получения новых форм лекарственного

препарата в качестве активного начала был выбран капреомицина сульфат для

иммобилизации в наночастицы полиэтилцианоакрилата.

В продолжение работ, используя найденные принципы формирования

пустых полиэтилцианоакрилатных наночастиц, исследована возможность

иммобилизации последних противотуберкулезным препаратом капреомицина

сульфатом.

Очевидно, что степень иммобилизации лекарства в матрицу

полиэтилцианоакрилата определяется как соотношением последних, так и

временем введения лекарства от начала процесса полимеризации в

реакционную среду. Используя литературные источники [77, c.25; 79, c.2111;

82, c.180; 87, c.45], в качестве соотношения этилцианоакрилат : капреомицина

сульфат взято 10 : 1, которое использовалось в работе при иммобилизации

64

лекарства в процессе эмульсионной полимеризации. На первом этапе

осуществлена попытка связывания капреомицина сульфата путем полного

введения последнего в реакционную среду, содержащую компоненты

эмульсионной системы. На рисунке 11 приведены данные по содержанию

фракций с нанометрическими размерами.