Производство тилозина

 

В современном животноводстве тилозин имеет три основных назначения: терапевтическое средство для лечения ряда инфекционных заболеваний (дизентерия, микоплазмоз и др.), профилактика инфекций, биостимулирующее средство. Производятся препарату кормового назначения, возможно применение в ветеринарной практике. Объем производства за рубежом 500–600 т/год. В числе ведущих производителей крупнейшие биотехнологические фирмы «Eli Lilly» – США, «Dista Products» – Великобритания.

Тилозин относится к группе макролидных антибиотиков (молекулярная масса 915 Да). Продуцентом тилозина является актиномицет Streptomyces fradiae 3830 (активность около 1500 ед./см³) (1 мг чистого антибиотика соответствует 1000 ед. активности по ингибированию Bacillus subtilis). Получены штаммы (за рубежом) с активностью до 5000 ед./см³.

Тилозин действует на микроорганизмы путем подавления белкового синтеза (связывается с рибосомами, выводя из строя рибосомный комплекс). Обладает широким антибактериальным спектром действия, в основном против грамположительных бактерий. Чистый тилозин (бесцветные кристаллы с температурой плавления 128–132°С), проявляет свойства слабого основания. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей из-за присутствия в молекуле различных функциональных групп. Растворимость в воде при 25°С составляет 0,5%. Хорошо реагирует с органическими и неорганическими кислотами, образуя соли.

Молекула тилозина включает углеводные компоненты (сахара: микароза, микаминоза, мициноза) и тилактонное кольцо:

 

Биосинтез тилозина многостадиен и протекает в три этапа: синтез тилактона, синтез сахаров, конверсия тилактона в тилозин. Для биосинтеза составляющих структуру молекулы тилозина компонентов питательная среда должна содержать глюкозу, жирные кислоты и аминокислоты.

В настоящее время разработан ряд прописей питательных сред, где в качестве источников необходимых элементов предложены самые различные вещества.

Для получения посевного материала используют независимую среду на основе соевой муки (источник азота) и глюкозы (источник углерода). В состав этой среды входят, %: соевая мука – 2,5; глюкоза – 2,5; кукурузный экстракт – 1,0; хлорид натрия – 0,2; мел – 0,5; подсолнечное масло – 0,2.

В случае замены глюкозы на соевое масло состав среды может измениться следующим образом, %: соевая мука – 0,58; кукурузный экстракт – 0,35; дрожжи кормовые – 0,58; соевое масло – 0,58; мел – 0,35.

Для культивирования продуцента в промышленных ферментаторах предложены следующие ферментационные среды (табл. 9.1).

Накопление тилозина происходит в идиофазе. В трофофазе антибиотик в заметных количествах не образуется.

 

 

Таблица 9.1

Состав производственных сред для микробиологического синтеза тилозина

Компонент среды	Среда 1, %	Среда 2, %	Среда 3, %
Мука соевая	2,5	–	–
Мука кукурузная	–	2,0	–
Мука рыбная	–	–	1,75
Глюкоза	2,5	–	–
Меласса	–	2,0	2,0
Хлорид натрия	0,2	0,2	0,1
Экстракт кукурузный	1,0	–	–
Хлорид аммония	–	0,7	–
K2HPO4	–	0,03	–
Сульфат магния	–	0,5	–
(NH4)2HPO4	–	–	0,4
Мел	0,5	0,5	0,2
Масло подсолнечное	3,0	1,5	–
Масло соевое	–	–	3,0

 

Ферментацию проводят в условиях асептики при температуре 27–29°С и рН среды 7,0–7,2. Интенсивность аэрации 1,5–0,9 об./(об.·мин). Наиболее интенсивное потребление кислорода наблюдается в трофофазе (вторые сутки), затем снижается. Эффективный синтез тилозина происходит при концентрации растворенного кислорода, составляющей не менее 30% от насыщения. Трофофаза длится 2–3 суток (антибиотик практически не образуется). Общая продолжительность процесса биосинтеза – до 220 ч (характерно повышение рН к концу процесса до 7,8–8,0). В настоящее время тилозин выделяют из нативного раствора двумя методами: адсорбционным (сорбция на ионообменной смоле) и экстракционным. Большое распространение получил экстракционный метод с использованием в качестве экстрагентов полярных растворителей (бутилацетат, этилацетат и др.).

К концу процесса биосинтеза мицелий актиномицета частично лизирует и большая часть тилозина сосредотачивается в культуральной среде (вне мицелиальной структуры), что упрощает выделение антибиотика.

Обработку КЖ с целью полного вывода антибиотика из клетки и очистки его от примесей осуществляют различными методами (флокуляция, коагуляция, термический нагрев, изменение рН и др.). Широкое распространение получил способ, основанный на введении в КЖ сульфата цинка (0,5%), вызывающего частичный лизис клеток и коагуляцию коллоидных и взвешенных веществ. Для удаления ионов Ca²⁺, содержащихся в КЖ, вводят щавелевую кислоту (около 0,5%) до рН 3,9–4,0. Фильтрационные свойства КЖ улучшаются при добавлении перлита (1–2% от объема КЖ). Фильтрацию осуществляют на фильтре-пресса ФПАКМ. Количество влажного осадка составляет около 4% от объема КЖ. Осадок высушивают (после гранулирования) и используют как кормовой препарат фрадизин.

Технологический процесс экстракционного выделения тилозина бутилацетатом состоит из следующих стадий (рис. 9.2):

– обработка КЖ щавелевой кислотой (0,5%) и сульфатом цинка (0,5%) при температуре 60°С;

– фильтрация КЖ на фильтре-прессе;

– экстракция тилозина бутилацетатом в соотношении нативный раствор: бутилацетат = 2,7: 1 при рН 8,8–8,9 (25%-ный раствор NaOH);

– реэкстракция тилозина водным раствором винной кислоты (2%) при соотношении бутилацетатный экстракт: раствор винной кислоты = (5–6): 1 с получением водорастворимой соли – тилозин-тартрата;

– нейтрализация экстракта 10%-ным раствором NaOH (или NH₄OH) до рН 4,5 и очитска раствора на ионообменной смоле SBW (или AB-17) в OH^– форме;

– концентрирование экстракта в роторно-пленочном испарителе в 2-3 раза;

– сушка концентрата распылением в мягких условиях (температура теплоносителя на входе в сушилку 120–160°С).

Рис. 9.2. Схема экстракционного выделения тилозина из культуральной жидкости:

1– коагулятор; 2 – фильтр-пресс ФПАКМ; 3 – сборник фильтрата; 4, 7 – смеситель трубчатый; 5, 8 – экстрактор-сепаратор «Россия»; 6 – сборник экстракта; 9 – сборник реэкстракта; 10 – ионообменная колонна; 11 – промежуточный сборник;

12 – роторный испаритель; 13 – сборник концентрата