Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Ход работы. 1. Сравнение действия неорганических катализаторов и ферментов





1. Сравнение действия неорганических катализаторов и ферментов. В три пробирки наливают по 5 мл 1%-ного раствора крахмала. В первую пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды, во вторую - 1 мл 10%-ной соляной кислоты, а в третью - 1 мл неразбавленной слюны. Пробирки 1 и 3 после перемешивания помещают в водяную баню при 380С, а пробирку 2 - в кипящую водяную баню. Через 15 - 20 мин. все пробирки вынимают из водяной бани и из каждой берут пробы для определения в них крахмала и глюкозы: первой - по реакции с йодом, второй - по реакции Троммера. Стеклянной палочкой наносят по капле раствора из каждой пробирки на стеклянную пластинку рядом с ранее нанесенной каплей раствора йода в йодиде калия, после чего капли соединяют и перемешивают. По интенсивности окраски пробы делают заключение о степени гидролиза крахмала. Для определения глюкозы из каждой пробирки берут по 3 мл раствора, добавляют 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди. Верхний слой жидкости нагревают до кипения. Появление желтого осадка оксида меди (I) или красного металлической меди указывает на наличие глюкозы. Результаты опыта заносят в таблицу:

Таблица 2

 

№ про- Субстрат Катализатор После инкубации
бирки     проба с йодом проба Троммера
Крахмал -    
Крахмал Соляная кислота    
Крахмал Амилаза слюны    

 

2. Специфичность действия амилазы (a-1,4-глюкан-4-глюкано-гидролаза; КФ 3.2.1.1.) и сахаразы (b-D-фруктофуранозид-фрукто-гидролаза; КФ 3.2.1.26). Нумеруют 4 пробирки. В пробирки 1 и 2 наливают по 2 мл раствора крахмала, в пробирки 3 и 4 - по 2 мл раствора сахарозы. Затем в пробирки 1 и 3 вносят по 0,5 мл разбавленного раствора слюны, в пробирки 2 и 4 - по 0,5 мл раствора препарата дрожжевой сахаразы. Перемешивают содержимое и ставят на 10 минут в водяную баню, нагретую до 38 - 400С. После охлаждения проделывают реакции с йодом на присутствие крахмала в пробах 1 и 2 и глюкозы - в пробах 3 и 4. Результаты опыта заносят в таблицу:


 

Таблица 3

 

№ пробирки Содержимое пробирки Проба с йодом Проба Троммера
Крахмал+ амилаза      
Крахмал+ сахараза      
Сахароза +амилаза      
Сахароза+ сахараза      

 

Делают заключение о специфичности изученных ферментов.

 

3. Влияние температуры на активность амилазы слюны. В четыре пронумерованные пробирки наливают по 2 мл 1%-ного р-ра крахмала. Пробирку 1 помещают в кипящую водяную баню, пробирку 2 - в водяную баню при 400С, пробирку 3 оставляют при комнатной температуре и пробирку 4 помещают в лед. Через 10 мин., когда содержимое пробирок примет заданную температуру, во все пробирки добавляют по 0,5 мл разбавленной слюны, перемешивают с помощью стеклянной палочки и оставляют в тех же условиях. Наблюдение за ходом гидролиза ведется по реакции с йодом. Для этого наносят на стеклянную пластинку несколько капель раствора йода и смешивают их с каплями гидролизуемой смеси, беря пробы через 1, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 мин. По изменению окраски крахмала с йодом судят о степени гидролиза крахмала в каждой пробирке. Результаты наблюдений заносят в таблицу, помечая буквой с (синяя окраска) положительную пробу с йодом на крахмал, буквой к - положительную пробу на декстрины (окраска красных тонов) и буквой ж - отрицательную пробу (желтая окраска йода).


 

 

Таблица 4

№ про- Температура Реакция с йодом по истечении времени, мин
Бирки в пробирке, 0С
             
             
15-20              
             

 

На основании полученных данных делают вывод о величине температурного оптимума для амилазы слюны.

 

4. Влияние рН на активность ферментов. Серии растворов с определенными значениями рН получают, используя фосфатный буфер. Две бюретки заполняют 115 М раствором гидрофосфата натрия (Na2HPO4 ´ 2H2O ) и 115 М раствором дигидрофосфата калия (КН2РО4). Растворы смешивают в определенных соотношениях таким образом, что в каждой пробирке получают по 5 мл буферной смеси с величинами рН: 5,59; 6,98; 7,38; 8,04.

Для получения 5 мл фосфатной буферной смеси с рН 5,59 из бюреток к 0,25 мл Na2HPO4 добавляют 4,75 мл раствора КН2РО4; рН 6,98 - к 3,2 мл раствора Na2HPO4 добавляют 1,8 мл раствора КН2РО4; рН 7,38 - к 4 мл раствора Na2HPO4 добавляют 1 мл раствора КН2РО4 и рН 8,04 - к 4,75 мл Na2HPO4 добавляют 0,25 мл раствора КН2РО4.

В каждую из четырех пробирок добавляют по 1 мл 0,5%-ного раствора крахмала, 1 мл разбавленной слюны и тщательно перемешивают содержимое с помощью стеклянной палочки. Далее все пробирки, не вынимая из них стеклянных палочек, помещают в водяную баню, нагретую до 400С. Спустя 3 - 5 мин. из всех пробирок палочками наносят на стеклянную пластинку по капле смеси рядом с предварительно уже нанесенными на нее каплями раствора йода. Капли соединяются, и, если наблюдается различие окраски с йодом в испытуемых пробах, пробирки вынимают из бани, охлаждают и добавляют в каждую по 3 - 4 капли раствора йода. При отсутствии заметного различия в окраске проб с йодом на стеклянной пластинке продолжают нагревание пробирок в водяной бане еще несколько минут, а затем вновь испытывают на пластинке пробы на степень расщепления крахмала. Эту операцию повторяют до тех пор, пока не произойдет заметных сдвигов в окраске проб с йодом.

Продолжают инкубацию всех проб в присутствии добавленного йода и для каждой из них отмечают время, когда исчезнет синее окрашивание (конец амилолитического расщепления). Полученные результаты отражают графически: по оси абсцисс наносят рН опытов, а по оси ординат - время расщепления крахмала при соответствующих значениях рН. Соединяя точки линией, получают кривую, характеризующую зависимость активности фермента от значения рН среды.

 

5. Действие активаторов и парализаторов на амилазу слюны. В штативе располагают тремя рядами 36 пробирок и нумеруют их в каждом ряду. Во все пробирки вливают из бюретки по 1 мл воды, а затем в первые пробирки каждого ряда - по 1 мл профильтрованной неразбавленной слюны. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Далее в каждом ряду 1 мл смеси из пробирки 1 переносят в пробирку 2, перемешивают, снова набирают 1 мл смеси и переносят в пробирку 3, и так вплоть до пробирки 12, из которой после перемешивания выливают 1 мл жидкости.

Во все пробирки превого ряда наливают по 1 мл воды (контрольный ряд), в пробирки второго ряда - по 1 мл раствора хлорида натрия и в пробирки третьего ряда - по 1 мл раствора сульфата меди. Далее во все пробирки наливают из бюретки по 2 мл раствора крахмала в следующем порядке: сначала в первые номера всех рядов, потом во вторые, и т.д. Содержимое перемешивают и ставят штатив в термостат при 400С на 15 мин. По охлаждении в каждую из них добавляют по капле р-ра йода и отмечают в каждом ряду номер пробирки, в которой реакция с йодом отрицательна. Деля степень разведения контрольной пробы, в которой реакция с йодом отрицательна, на степень разведения соответствующих проб с исследуемыми эффекторами, вычисляют, во сколько раз активатор (NaCl) или ингибитор (CuSO4) стимулирует или тормозит действие амилазы слюны.

 

Работа 7. Качественные реакции на углеводы

 

Оборудование, реактивы: пипетки на 1, 2 и 5 мл; пробирки химические; баня водяная; 1-нафтол (10%-ный спиртовой); серная кислота (конц.); гидроксид натрия (10%-ный); сульфат меди (5%-ный); реактив Фелинга; реактив Селиванова; орциновый реактив; раствор Люголя; этиловый спирт; хлорид натрия (крист.).

Материалы: глюкоза, мальтоза, сахароза, арабиноза, фруктоза, крахмал, гликоген (1%-ные растворы).






Дата добавления: 2014-10-22; просмотров: 391. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.005 сек.) русская версия | украинская версия