Определение уровня IgМ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии
1. Готовят 1, 25-1, 5% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0, 1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8, 6 (на 1 л воды берут 0, 8 г веронала и 4, 5 г мединала). Навеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на водяной бане при 56 °С до полного растворения полимера. 2. В раствор агара добавляют рассчитанное количество (расчет производят, исходя из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки, быстро и тщательно перемешивают. Каждый вариант антиизотипической антисыворотки добавляют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы). 3. Раствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стеклянные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик для ровного затвердевания агара/агарозы в гель. Гель прозрачен и бесцветен. На стандартное предметное стекло для микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуется примерно 3, 2 мл смеси раствора агара с антисывороткой. 4. В геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) ряда лунок. Расстояния между центрами лунок - порядка 1, 5 см. 5. Заранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентрациях. 6. В три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки - также по 5 мкл - заливают испытуемые сыворотки. 7. Стекла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 °С 24-48 ч. За это время происходит спонтанная диффузия белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимися в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимися в агаровом геле. Поскольку диффузия свободно идет во всех направлениях, преципитаты имеют форму правильных колец. Преципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измеряют в миллиметрах. 8. Для снижения фона образования неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой - 5% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор меняют несколько раз. 9. Если задачи работы требуют долгосрочного хранения препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и красят анилиновыми красителями, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красителя - 50 мл ледяной уксусной кислоты и 150 мл воды). Окрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).
|
Рис. 4.2. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая
