Серологический метод исследования
Серологический метод представляет собой совокупность реакций, основанных на взаимодействии антиген-антитело (Аг-Ат) и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма антител к антигенам возбудителей инфекционных болезней, либо собственно микробных антигенов. Серологический метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Большинство реакций этого метода просты в проведении и учете, доступны широкому кругу лабораторий, как правило, безопасны, экономичны, поддаются стандартизации. К недостаткам серологического метода можно отнести: 1) косвенный характер результата, когда об этиологии болезни судят не по выделению возбудителя, а по ответу (иммунному) организма на возбудитель; 2) необходимость парентерального вмешательства в организм больного; 3) в большинстве случаев позднюю постановку диагноза, что объясняется природной динамикой гуморального иммунного ответа; 4) возможность принять анамнестические Ат (как результат ранее перенесенного заболевания или вакцинации) за Ат к текущей инфекции. При определении микробных антигенов 3-й и 4-й недостатки отсутствуют, но необходимо учитывать особенности циркуляции антигенов разных микробов и соотносить эти особенности с возможностью взятия материала для исследования. Этапы серологического метода: 1) взятие материалов для исследования. В большинстве случаев материалом является сыворотка крови. Ее получают после образования сгустка крови, кровь следует забирать в строго асептических условиях по стандартной методике, 2) выбор серологической реакции для данного случая зависит от цели исследования, предполагаемого заболевания, фазы болезни, материала для исследования, чувствительности реакции, возможностей конкретной лаборатории. Для выявления Ат, а также Аг используют реакции агглютинации (РА), пассивной гемагглютинации (РПГА)), иммунофлюоресценции (РИФ), торможения гемагглютинации (РТГА), преципитации, флоккуляции, реакцию связывания комплемента (РСК) и др. 3) постановка серологической реакции, 4) регистрация серологической реакции с целью определения присутствия серологических маркеров инфекции. Разнообразным серологическим реакциям свойственно несколько общих характеристик: 1) так как любые серологические реакции являются реакциями взаимодействия Ат и Аг, то во всех случаях для установления присутствия Ат в исследуемом субстрате необходим набор известных стандартных корпускулярных или растворимых Аг, называемых диагностикумами. В свою очередь, для установления присутствия Аг нужен набор иммунных диагностических сывороток, 2) взаимодействие Аг и Ат осуществляется только в присутствии электролита, в качестве которого обычно используют изотонический раствор хлорида натрия или буферные смеси, рН системы должен быть около 7, 3) для образования комплекса Аг-Ат требуется период инкубации при особых температурных условиях (от +4 °С до 37 °С). Образование специфического иммунного комплекса происходит быстро; видимого простым глазом феномена (агглютинации, лизиса и др.) - медленно, через несколько часов или даже суток, 4) оба компонента серологической реакции (антиген и антитела) должны присутствовать в эквивалентном соотношении. Избыток какого-либо из компонентов блокирует образование комплекса Аг-Ат и способствует ложно отрицательным результатам. Учет серологических реакций осуществляют визуально, иногда с помощью лупы. Суть учета серологической реакции сводится к определению феномена связывания Аг и Ат по образованию комплекса Аг-Ат. Визуально образование комплекса Аг-Ат сопровождается двумя основным феноменами - агглютинацией и преципитацией. Различия между ними определяются особенностями антигенов и антител, специфичных к ним. В то же время, среди микробных антигенов присутствуют и такие, которые индуцируют синтез непреципитирующих, образование комплекса Аг-Ат в данном случае не сопровождается ни феноменом агглютинации, ни феноменом преципитации, а выявление факта образования комплекса Аг-Ат требует маркирования диагностического компонента реакции специальными метками, либо перевода диагностического антигена в другое агрегатное состояние. При оценке реакции применяют 3 главных критерия: 1) наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.); 2) диагностический титр, 3) нарастание титра Ат в течение болезни в 4 раза и более. Наличие реакции устанавливают по визуальным феноменам или по связыванию иммунохимического маркера. Для оценки интенсивности серологической реакции используют принцип 4 " +" (табл.7).
Таблица 7. Система оценки серологических реакций по 4 " +" для реакций агглютинации и преципитации
Для количественного представления результатов серологической реакции применяют понятие титра антител или антигенов. Для определения тира Ат (или титра Аг) необходимо поставить серологическую реакцию, приготовив ряд разведений сыворотки крови или иного материала (раститровать). При приготовлении разведений сыворотки крови используют раствор электролита (чаще всего изотонической раствор хлорида натрия). Шаг разведения (титрования) задается соотношением объема раствора электролита и объема сыворотки крови. Например, при последовательных разведениях с шагом в 2 раза в 1-й пробирке смешиваются равные объемы раствора электролита и сыворотки крови, при шаге в 5 раз к 4-м объемным частям раствора электролита добавляют 1 объем сыворотки, при шаге в 10 раз - к 9 объемам раствора электролита добавляют 1 объем сыворотки крови (табл.8). Таблица 8
|
