Методические указания к выполнению работы

Морфологические признаки дрожжей изучаютпросматривая препараты «раздавленная капля» с сухими объективами (8х, 40х).

Определение гликогена – полисахарид, животный крахмал содержится в клетке у эукариот и прокариот в виде включений (веществ, возникающих в результате метаболизма клетки). Служит в качестве запасного материала и при недостатке углеводов в питательной среде используется клеткой. Гликоген окрашивается йодом в бурый цвет.

Для обнаруже­ния гликогена используют крепкий раствор йода в йодистом калии (7 г йода + 20 г йодистого калия + 100 см³ воды). На пред­метное стекло наносят небольшую каплю раствора йода и размеши­вают в ней петлей такую же каплю жидкой культуры дрожжей. На пре­парат накладывают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой и через 2—3 мин микроскопируют. Наличие в цитоплазме бурых зернышек или крапинок указывает на присутствие гликогена. Пе­ред обработкой раствором йода рекомендуется обезжи­ривать препарат путем фиксирования в смеси спирта с эфиром (1: 2). Это делается для того, чтобы удалить из клетки жир, который тоже отчасти окрашивается йодом. При подогревании окрашенного йодом препарата до 60° С красно-бурая окраска гликогена исчезает, а после охлаждения восстанавливается. Иногда гликогену может быть примешана гранулеза, и при слабом рас­творе йода получается синее окрашивание, при креп­ком — красно-бурое. На препарате сахаромицетов много почкующихся клеток. Поскольку гликоген активно расходуется в процессе метаболизма, то его можно обнаружить только в материнских клетках. В зависимости от количества накопленного углевода их цвет может меняться от ярко-желтого до бурого. В растущих клетках (почках) гликоген как правило не обнаруживается.

Обнаружение волютина (метахроматиновые зерна). Некоторые бактерии и дрожжи содержат в цитоплазме клетки вещество, со­стоящее из неорганических полифосфатов, запасное фосфор- и азотосодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты, получившее название волютин. В дрожжевой клетке при состоянии покоя волютин можно обнаружить в виде большой круглой капли внутри вакуоли. При со­стоянии активного обмена волютин в клетках распола­гается мелкими каплями по стенкам вакуоли или непо­средственно под клеточной стенкой. В большом количе­стве волютин накапливается у дрожжей перед почкованием. Накоп­ление волютина особенно интенсивно происходит при выращивании дрожжей на средах, богатых фосфатами.

Для обнаружения волютина в дрожжах используют расу XII дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на твердой питательной среде. Метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На предметное стекло наносят каплю воды, петлей в форме замкнутого кольца вносят в неё культуру дрожжей, распределяют равномерно и круговыми движениями делают тонкий мазок на площади 1 – 2 см². Препарат высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и окрашивают метиленовым синим по Лёфлеру (1,5 – 2 мин), после чего смывают краситель водой и обрабатывают препарат раствором серной кислоты с массовой долей 5 % в течение 5 – 7 сек. Кислоту смывают водой, препарат высушивают и просматривают с иммерсионным объективом. Цитоплазма дрожжевых клеток при этом окрашивается в голубой цвет, а гранулы полифосфатов – в синий. Можно окрашивать фиксированные препараты 20-30 с карболовым фуксином Циля. Через 0,5-1,0 мин промыть препарат водой, обесцветить 20-30 с раствором Н₂SO₄ с массовой долей 1%, промыть, дополнительно окрасить 20-30 с метиленовым синим (1: 40), промыть, промокнуть, просмотреть с иммерсионной системой. Гранулы волютина приобретают красный цвет, цитоплазма – синий.

Определение процентного содержания нежизнеспособных клеток. На предметном стекле смешивают каплю суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII, выращенной на неохмеленном пивном сусле, смеши­вают с каплей метиленового синего. В препарате просматривают 10 полей зрения. Мертвые клетки окрашены в нем в синий цвет, живые остаются бесцветными. Определяют процентное со­держание нежизнеспособных клеток по отношению к общему числу клеток, наблюдаемых в поле зрения. Активные культуры дрожжей, используемые для засева, содержат не более 5 % мертвых клеток.

Определение способности дрожжей к размно­жению. Количество почкующихся клеток характеризует спо­собность дрожжей к размножению: активные дрожжи содержат 40—70 % клеток с почками. Из дрожжевой суспензии готовят препарат «раздавленная капля» и определяют процентное содержание почкующихся клеток по отношению к суммарному количеству дрожжей с почками и без них.

Подсчет количества клеток в счетной камере. Для подсчета клеток крупных бактерий, дрожжей, конидий плесневых грибов применяют различные счетные камеры, из которых наиболее часто используют камеру Горяева (рис. 39). Она представляет собой толстое предметное стекло, разделенное глубокими бороздками на поперечные площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена попо­лам. На каждой ее части нанесена сетка. Боковые площадки расположены на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного стекла.

Сетка камеры Горяева разделена на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 квадратов в ряду). Площадь большого квадрата равна ¹/₂₅ мм² и разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадрата равна ¹/₂₀ мм, площадь – ¹/₄₀₀ мм². Часть больших квадратов разграфлена вертикально, горизонтально или не разграфлена.

Камеру и специальное шлифованное покровное стекло хорошо промывают и просушивают. На поверхность сеток наносят не­большую каплю исследуемой суспензии, накрывают шлифованным стеклом и притирают покровное стекло к боковым площадкам. Жидкость под покровным стеклом должна растекаться по всей сетке равномерно, без пузырьков. Для того чтобы объем жидкости точно соответствовал расчетному объему камеры, покровное стекло притирают к боковым площадкам камеры до появления цветных колец (можно вначале притереть стекло, а потом из пипетки осторожно заполнить камеру). Под­счет клеток рекомендуется производить через 3—5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и распо­ложились в одной плоскости. Подвижные формы микроорганизмов перед нанесением на сетку следует убить нагреванием или добавлением 0,5 % формалина.

Камеру помещают на предметный столик микроскопа и рассматривают с объективом 8^Х или 40^X (в зависимости от размеров клеток изучаемого объекта). Для получения достоверных результатов подсчет следует про­водить в 5 больших или 20 малых квадратах по диагонали или по углам сетки и в центре в трех препаратах. Учитывают все клетки, находящиеся внутри квадрата и на пограничных линиях, если они больше чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех сторон квадрата; клетки, расположенные вне квадрата, не учитывают.

Количество клеток в 1 мл исходной суспензии:

,

 

где С – число клеток в 1 мл суспензии;

а – среднее число клеток в квадрате сетки;

h – глубина камеры, мм;

S – площадь квадрата сетки, мм²;

n – степень разведения исходной суспензии;

1000 мм³ = 1 мл.

 

 

Контрольные вопросы.

 

1. К каким группам грибов относятся дрожжи?

2. Назовите физиологические признаки дрожжей. Где используются дрожжи?

3. Опишите форму клеток дрожжей и способы их размножения.

4. Дайте характеристику аспорогенных дрожжей.

5. Какие включения клеток дрожжей Вы знаете?

6. Как обнаруживается волютин в дрожжах?

7. Как определить способность дрожжей к размножению?

8. Как обнаружить гликоген в клетках дрожжей?

9. Каким методом можно определить количество дрожжей в 1мм суспензии?