Интерпретация реультатов

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Лабораторная работа №1.

Выделение плазмидной ДНК с использованием органических растворителей.

В процессе выделения нуклеиновых кислот из биологического образца необходимо провести лизис клеток, инактивацию клеточных нуклеаз и собственно отделение нуклеиновых кислот от клеточной массы.

 

Принцип метода: метод выделения геномной ДНК основан на лизисе мембран детергентом додецилсульфатом натрия (SDS) с последующей экстракцией ДНК при помощи органическийх растворителей (фенола и хлороформа) (рис.4).

Рис.4 Схема выделения ДНК при помощи органических растворителей. (http://kak.znate.ru/docs/index-49305.html)

 

Оборудование:

1. Термостат;

2. Термокачалка;

3. Микроцентрифуга;

4. Вортекс;

5. Автоматические пипетки.

 

Расходные материалы:

1. Стерильные чашки Петри;

2. Стерильные стеклянные пробирки;

3. Эппендорфы;

4. Сменные носики для автоматических пипеток.

 

Реагенты:

1. LB на 100мл: пептон — 1г, дрожжевой экстракт — 0,5г, NaCl — 0,5г;

2. Ампициллин сток 50мг/мл (рабочая — 2 мкл/мл);

3. РНК-аза;

4. Раствор I: 8%глюкоза, 20мМ трис-HCl, pH 8,0, 100мМ ЭДТА;

5. Раствор II: 0,2М NaOH, 1% SDS;

6. Раствор III: 3М ацетат калия, pH 5,2;

7. Фенол;

8. Хлороформ;

9. 96%, 70% спирт.

Биологический материал: колонии E.Coli

 

Ход работы:

1. В пробирку с 3 мл среды LB, содержащей антибиотик засеять одну трансформированную колонию E.Coli с чашки и оставить на ночь при 37°С раскачиваться;

2. Осадить клетки в течении 1 мин при max оборотах, супернатант удалить, осадок клеток тщательно ресуспендировать в 100 мкл раствора I;

3. Добавить 200 мкл раствора II, перемешать переворачиванием, избегая сильного встряхивания, выдержать 5 мин;

4. Добавить 200 мкл раствора III, перемешать переворачиванием и снова инкубировать 10 мин;

5. Центрифугировать 10 мин при 12000 об/мин;

6. Супернатант аккуратно отобрать в эппендорф, добавить РНК-азу (1-100 от объёма) и прогревать 5 мин при 65°С;

7. Добавить фенол-хлороформ (400:400), центрифугировать 10 мин про 10000 об/мин;

8. Отобрать водную фазу в новую пробирку, добавить 400 мкл хлороформа, центрифугировать 10 мин при 10000 об/мин;

9. Снова отобрать водную фазу, переосадить 2-2,5 объёмами спирта, инкубировать 20 мин при -20°С;

10. Центрифугировать 10 мин при 12000 об/мин. Осадок промыть 70% этанолом, высушить и растворить в 20-30 мкл ТЕ буфера.

 

Интерпретация реультатов

Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать, измерив его оптическую плотность при длине волны 260нм. Так как белки поглощают при длине волны 280нм, отношение А₂₆₀/А₂₈₀ используется для определения частоты нуклеиновых кислот. Отношение между оптическими плотностями для чистых препаратов ДНК и РНК на 260 и 280нм должно быть равно 1,8 и 2 соответственно. Поглощение на 230нм отражает загрязнение образца такими веществами, как углеводы, пептиды, фенолы или ароматические соединения. Отношение A₂₆₀/A₂₃₀ в случае чистых образцов должно быть примерно 2,2.

Концентрацию расчитывать, по закону Бугера — Ламберта — Бера, используя формулу (1), принимая средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК равным 0,020 (мкг/мл)⁻¹ см⁻¹.

 

 

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Какие существуют основные методы выделения ДНК из живых образцов?

2. В чём состоят основные различия при выделении ДНК на колонках и с использованием органических растворителей?

3. Какая методика используется для многократного увеличения интересующей нас области ДНК?

4. Опишите принцип спектрофотометрического анализа нуклеиновых кислот.

5. Охарактеризуйте раствор ДНК, имеющий отношение 260/280 = 1,6 и 260/230 = 1,3.