Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Интерпретация реультатов

P.S. Уважаемые соискатели, проверяйте Вашу анкету перед отправкой, пожалуйста! Внимательно проверяйте грамматические и пунктуационные ошибки, оформление, корректность предоставленных данных. 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Лабораторная работа №1.

Выделение плазмидной ДНК с использованием органических растворителей.

В процессе выделения нуклеиновых кислот из биологического образца необходимо провести лизис клеток, инактивацию клеточных нуклеаз и собственно отделение нуклеиновых кислот от клеточной массы.

 

Принцип метода: метод выделения геномной ДНК основан на лизисе мембран детергентом додецилсульфатом натрия (SDS) с последующей экстракцией ДНК при помощи органическийх растворителей (фенола и хлороформа) (рис.4).

Рис.4 Схема выделения ДНК при помощи органических растворителей. (http://kak.znate.ru/docs/index-49305.html)

 

Оборудование:

1. Термостат;

2. Термокачалка;

3. Микроцентрифуга;

4. Вортекс;

5. Автоматические пипетки.

 

Расходные материалы:

1. Стерильные чашки Петри;

2. Стерильные стеклянные пробирки;

3. Эппендорфы;

4. Сменные носики для автоматических пипеток.

 

Реагенты:

1. LB на 100мл: пептон — 1г, дрожжевой экстракт — 0,5г, NaCl — 0,5г;

2. Ампициллин сток 50мг/мл (рабочая — 2 мкл/мл);

3. РНК-аза;

4. Раствор I: 8%глюкоза, 20мМ трис-HCl, pH 8,0, 100мМ ЭДТА;

5. Раствор II: 0,2М NaOH, 1% SDS;

6. Раствор III: 3М ацетат калия, pH 5,2;

7. Фенол;

8. Хлороформ;

9. 96%, 70% спирт.

Биологический материал: колонии E.Coli

 

Ход работы:

1. В пробирку с 3 мл среды LB, содержащей антибиотик засеять одну трансформированную колонию E.Coli с чашки и оставить на ночь при 37°С раскачиваться;

2. Осадить клетки в течении 1 мин при max оборотах, супернатант удалить, осадок клеток тщательно ресуспендировать в 100 мкл раствора I;

3. Добавить 200 мкл раствора II, перемешать переворачиванием, избегая сильного встряхивания, выдержать 5 мин;

4. Добавить 200 мкл раствора III, перемешать переворачиванием и снова инкубировать 10 мин;

5. Центрифугировать 10 мин при 12000 об/мин;

6. Супернатант аккуратно отобрать в эппендорф, добавить РНК-азу (1-100 от объёма) и прогревать 5 мин при 65°С;

7. Добавить фенол-хлороформ (400:400), центрифугировать 10 мин про 10000 об/мин;

8. Отобрать водную фазу в новую пробирку, добавить 400 мкл хлороформа, центрифугировать 10 мин при 10000 об/мин;

9. Снова отобрать водную фазу, переосадить 2-2,5 объёмами спирта, инкубировать 20 мин при -20°С;

10. Центрифугировать 10 мин при 12000 об/мин. Осадок промыть 70% этанолом, высушить и растворить в 20-30 мкл ТЕ буфера.

 

Интерпретация реультатов

Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать, измерив его оптическую плотность при длине волны 260нм. Так как белки поглощают при длине волны 280нм, отношение А260280 используется для определения частоты нуклеиновых кислот. Отношение между оптическими плотностями для чистых препаратов ДНК и РНК на 260 и 280нм должно быть равно 1,8 и 2 соответственно. Поглощение на 230нм отражает загрязнение образца такими веществами, как углеводы, пептиды, фенолы или ароматические соединения. Отношение A260/A230 в случае чистых образцов должно быть примерно 2,2.

Концентрацию расчитывать, по закону Бугера — Ламберта — Бера, используя формулу (1), принимая средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК равным 0,020 (мкг/мл)−1 см−1.

 

 

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.Какие существуют основные методы выделения ДНК из живых образцов?

2. В чём состоят основные различия при выделении ДНК на колонках и с использованием органических растворителей?

3. Какая методика используется для многократного увеличения интересующей нас области ДНК?

4. Опишите принцип спектрофотометрического анализа нуклеиновых кислот.

5. Охарактеризуйте раствор ДНК, имеющий отношение 260/280 = 1,6 и 260/230 = 1,3.




<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
СПАСИБО ЗА ЗАПОЛНЕННУЮ АНКЕТУ! | За период с 1936 по 1940 год Героями Советского Союза стали семеро орловчан.

Дата добавления: 2015-08-30; просмотров: 661. Нарушение авторских прав


Рекомендуемые страницы:


Studopedia.info - Студопедия - 2014-2020 год . (0.003 сек.) русская версия | украинская версия