Возбудитель чумы

 

3.1. Общая характеристика

 

Возбудитель чумы (Yersinia pestis (Leman и Neumann, 1896; van Logem, 1944) (является типовым видом рода Yersinia, относящимся к семейству Enterobacteriaceae. Помимо чумного микроба, к этому роду относятся еще 6 видов бактерий: Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. ruckeri, Y. frederiksenii и Y. kristensenii. По культурально-биохимическим и некоторым другим свойствам ближе всего к чумному микробу стоят первые два вида, из которых Y. pseudotuberculosis называют даже его двойником. Однако по эпидемиологическим особенностях и патогенезу вызываемых инфекции Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica существенно оличаются от Y. pestis

Ниже приводится общая характеристика Y. pestis, основанная на работах В. М. Туманского [1958], R. Pollitzer [1954] и G. S. Wilson и A. A. Miles [1964], а также на собственных данных [Домарадский И. B, 1971; Домарадский И. В. и др., 1974].

По морфологии (Y. pestis относительно мелкая, прямая, с закругленными концами палочка длиной 1-3 мкм и шириной 0,3-0,7 мкм. Отличается большим полиморфизмом, особенно в мазках из содержимого бубонов и 3 %-солевого агара. Спор не образует. В организме животных и людей и на сывороточном или кровяном агаре при температуре 37 (С обычно образует капсулу. Легко воспринимет анилиновые красители. Окрашивается биполярно. Грамотрицательна. Кислотоустойчивостью не обладает. Неподвижна (без жгутиков) (рис.6,7).

На пластинках агара сначала образует прозрачные "кружевые платочки", что имеет диагностическое значение, а затем вырастает в виде блестящих, серовато-белых, прозрачных колоний с выпуклыми мелкозернистыми центрами и плоскими, волнистыми ("фестончатыми") краями (R-форма) (рис.8). При температуре 26-28 (С колонии суховаты, а колонии же, полученные при температуре 37 (С имеют маслянистую консистенцию, вследствие чего клетки легче суспендируются, иногда тянутся за петлей. По мере старения центр их становится более грубым, менее прозрачным и приобретает коричневатый оттенок. На кровяном агаре через 48 ч. при температуре 37 (С образует подобные же колонии, но менее дифференцированные; иногда вызывает (-гемолиз, а также легкое просветление среды или делает её более тёмной. На скошенном агаре микроб растёт в виде сероватого, вязкого, влажного, нежного, прозрачного налёта. На дезоксихолатно-цитратном агаре при температуре 37 (С через 48 ч. вырастает в виде немногочисленных красноватых колоний величиной с булавочную головку. На агаре МакКонки через 24 ч. при той же температуре даёт слабый сливной рост, едва различаемый невооруженным глазом. Столбик среды Тимофеевой-Головачёвой окрашивает в красновато-оранжевый цвет, скошенную поверхность не изменяет. На пластинках желатины формирует плоские серые колонии с зернистыми центрами. В столбике желатины растёт по поверхности и в глубине, среду не разжижает. На свернутой сыворотке по Лёффлеру через 24 ч. при температуре 37 (С даёт довольно хороший сливной рост, разжижения не вызывает. Молоко с лакмусом не свертывает, цвет его не изменяет или вызывает легко покраснение. На картофеле развивается слабо.

В бульоне обычно образует хлопьевидный или порошковидный, легко распадающийся при встряхивании осадок, жидкость над ним остается прозрачной. Часто образует нежную пленку; в старых культурах от неё вглубь среды могут отходить нити? "сталактиты" (рис.9).

В связи с относительной неприхотливостью Y. pestis растёт на синтетических средах с аминокислотами (в качестве источников азота) и ферментируемыми углеводами. В витаминах и азотистых основаниях, как правило, не нуждается. Однако аминокислотные потребности у штаммов из разных природных очагов сильно варьируют. Кроме того, они могут меняться в зависимости от температуры культивирования. В связи с этим следует подчеркнуть неоднородности популяций чумного микроба по аминокислотным потребностям, которая безусловно имеет определенную биологическую целесообразность. Весьма вероятно, что при неблагоприятных условиях внешней среды возбудитель чумы может выживать не только за счёт появления прототрофных мутантов, но и благодаря синтрофизму между ауксотрофными мутантами, отличающимися по потребности в аминокислотах [Лебедева С. А. и др., 1970].

Факультативный анаэ роб. Для роста из небольших посевных доз на плотных средах нуждается в понижении окислительно-восстановительного потенциала, достигаемом, в частности, за счёт добавления сульфита натрия, крови или гемина. На жидких средах хорошо развивается при аэрации. Оптимум температуры роста? 26-28 (С, пределы? от (2 до 45 (С. Оптимум pH (7,0--7,2, пределы (5,0-9,5.

Чаще образует бактериоцин (пестицин I), свертывает плазму крови и вызывает фибринолиз. Мочевину обычно не разлагает (см. стр. 55). Индол и ацетилметилкарбинол не образует. Продукция сероводорода бывает на жидких средах с ферментируемыми сахарами. Дает положительную реакцию на аммиак и обычно с метиловым красным. Метиленовую синь редуцирует редко. Нитраты чаще востанавливаает до нитритов. Каталазу и оксидазу образует. Декарбоксилирует аргинин и нерегулярно гистидин. Углеводы и их производные ферментирует до кислоты без газа (табл. 11).

Содержание Г Ц в ДНК равно 46 % (по температуре плавления).

В чистых культурах Y. pestis высокочувствительна к обычным дезинфектантам. Отличается небольшой устойчивостью в окружающей среде; чувствительна к высушиванию, особенно при резких колебаниях влажности; быстро погибает под действием солнечных лучей. В мокроте и крови остается жизнеспособной значительно дольше. Низкую температуру переносит хорошо, в замерзших трупах сохраняется несколько месяцев.

Чумной микроб чувствителен ко многим сульфаниламидным препаратам и антибиотикам, но резистентен к пенициллину (образует пенициллиназу).

Закончив общую характеристику тинкториальных и культурально-биохимических свойств Y. pestis, остановимся на некоторых наиболее важных, с нашей точки зрения, аспектах ее биологии.

 

3.2. Морфологические особенности

 

Клетка Y. pestis построена по типу, присущему клеткам всех грамнегативных бактерий, но отличается рядом особенностей [Кац, Л. Н., 1966; Голубиниский Е. П. и др., 1971; Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992]. Скелет клетки, представленный трехслойной мембраной, придает клетке овоидную форму со вздутьями по бокам и закруглениями на концах. Средний слой отличается способностью интенсивно абсорбировать красители на полюсах клетки (столь типичная для чумного микроба биполярная окраска обусловливается именно этим). Структурную основу внешней мембраны клеточной стенки составляет липополисахаридно-белковый комплекс, однако у чумного микроба липополисахарид (ЛПС) подобен ЛПС R-мутантов грамотрицательных бактерий, чем, в частности, объясняются характерные особенности роста Y. pestis на искусственных питательных средах [Бахрах Е. Э.,1973; Тараненко Т. М., 1988]. На поверхности клеточной стенки при надлежащих условиях культивирования микроба выявляются пилеобразные или фимбриоподобные структуры, имеющие белковую природу [Водопьянов С. О. и др., 1985; Linder L. E. et al., 1990]

После выращивания при температуре 37 (С и в мазках из органов животных клетки окружены гликопротеидной капсулой.

 

3.3. Метаболизм

 

По типу метаболизма все иерсинии, включая чумной микроб, характеризуются как типичные представители семейства кишечных бактерий. Прежние наши возражения против подобного заключения были основаны на иных подходах к таксономии бактерий. Нам казалось, что при классификации микробов нужно исходить из экологического принципа, который учитывает все особенности, а не ограничиваться анатомо-физиологическими данными о бактериях [Домарадский И. В., 1971]. Впрочем, мы и теперь так считаем и если все же мы говорим, что Yersinia являются типичными представителями семейства Enterobacteriaceaе, то, во-первых, следуем устоявшейся традиции, а, во-вторых, хотим подчеркнуть присущую всем членам этого семейства специфику обмена веществ (и только!). Вместе с тем, мы снова подчеркиваем, что по крайней мере Y. pestis, по характеру обитания в природе, а также патогенезу и механизму передачи вызываемой в естественных условиях инфекции на "кишечные" бактерии никак не похож.

Большое значение для физиологии чумного микроба имеет гликолиз? универсальный и в тоже время филогенетически наиболее древний путь метаболизма углеводов. Об этом свидетельствуют, как данные табл. 11, так и сведения о конечных продуктах диссимиляции углеводов (табл. 12) и наличии у него соответствующих ферментов. Катаболизм других углеводов и близких к ним соединений обычно начинается с превращения в субстраты, доступные для сбраживания. Примечательно, что Y. pestis присуща способность не только к анаэробному, но и к аэробному гликолизу, энергетически более выгодному, чем первый. Не есть ли все это следствие "солидного" возраста возбудителя чумы, ставшего им еще задолго до появления человека, в мезозое, т. е на заре царства млекопитающих? единственных хозяев микроба?

Что касается окисления моносахаридов до двуокиси углерода с промежуточным образованием пентозо- и гептозофосфтов (гексозомонофосфатный путь или пентозный цикл), то его удельный вес в метаболизме чумного микроба весьма невелик, хотя, по-видимому и достаточен для обеспечения его пентозами для образования нуклеиновых кислот [Рублев Б. Д., Голубинский Е. П., 1971]. Низкую активность этого цикла связывают с отсутствием у чумного микроба глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, отличающее его от возбудителя псевдотуберкулёза [Mortlock R., Brubaker R., 1962].

Помимо гликолиза, источником энергии для чумного микроба является окисление глюконата по схеме Энтнера-Дудорова, что установлено R. Mortlock [1962] и подтверждено мною и моими коллегами [Рублев Б. Д. и др., 1971]. Однако как и для других аэробных микоорганизмов, основным источником энергии для чумного микроба служит цикл Кребса. При этом обращает на себя внимание то, что ему присущ даже глиоксилатный цикл, который используется в качестве источника метаболитов для синтеза углеродных скелетов углеводов, причём для этого он обладает несколькими формами изоцитрат-лиазы [Hiller S., Charnetzky W., 1981].

В связи с углеводным обменом нужно заострить внимание читателей еще на двух вопросах, которые тесно связаны с таксономией. Прежде всего мы имеем в виду отношение Y. pestis к глицеролу. Как известно уже давно [Безсонова, 1928], по этому признаку различают две группы штаммов? глицериннегативные и глицеринпозитивные. В подавляющем большинстве случаев первые выделяются в тех очагах, где хранителями чумного микроба являются крысы ("океанические" штаммы). Чаще всего оканические штаммы встречаются в очагах тропического пояса. Вторые же обычно выделяются от сусликов, сурков и песчанок. В связи с этим распространение глицеринпозитивных штаммов географически привязано к ареалам распространения указанных видов грызунов ("континентальные" штаммы). По нашим данным [Домарадский И. В. и др., 1974], причина негативного отношения чумного микроба к глицерину может заключаться в утрате им только одного фермента? первого в цепи последующих, а именно глицеролдегидрогеназы. Однако чем объяснить подобную "диссоциацию" чумного микроба? особенностями обмена веществ его хозяев или какими-то другими факторами (абиотическими?), пока никто не знает.

Второй вопрос касается рамнозы. После того как А. А. Безсонова [1929] предложила среду с рамнозой для дифференциации Y. pestis от Y. pseudotuberculosis, отношение чумного микроба к этой пентозе стало предметом многочисленных исследований. При этом выяснилось, что неспособность ферментировать рамнозу является весьма постоянным признаком чумного микроба. Однако, как показала E. Englesberg [1957а], начиная с 6-го дня инкубации могут появляться рамнозопозитивные клоны, с частотой порядка 10-11, с чем и связана "поздняя" ферментация, которую подчас наблюдают в лабораториях. Продолжив изучение отношения к рамнозе, E. Englesberg [1957б] показала, что рамнозопозитивные мутанты чумного микроба окисляют эту пентозу только в том случае, если их предварительно выращивают в её присутствии. При выращивании же на среде с глюкозой окисление рамнозы начинается лишь после 50-минутного контакта с ней и максимальное потребление кислорода достигается к концу 2-го часа. Однако при этом рамноза окисляется неполностью, причём одним из продуктов распада является 2-оксипропионовый альдегид. У "адаптированных" рамнозопозитивных мутантов были обнаружены изомераза рамнозы, катализирующая её превращение в рамнулозу, и рамнулозокиназа.

Однако, помимо разложения рамнозы в поздние сроки, причина которого установлена E. Englesberg [1957а], встречаются случаи, когда оно регистрируется одновременно с ферментацией других углеводов; обычно с этим сталкиваются при работе со штаммами, выделенными в горных очагах. Чем объяснить эту особенность "горных" штаммов, сказать мы не можем.

Реакции переаминирования являются центральными реакциями в белковом обмене животных, растений и микроорганизмов. Поэтому неудивительно, что они выявлены и у чумного микроба [Оленичева Л. С., Атарова Г. Т., 1967]. Обращает на себя внимание то, что в отличие от Y. pseudotuberculosis, чумной микроб лишен (-глутаматтрансферазы, (факт, представляющий интерес для их дифференциации [Bercovier H. et al., 1981]. Помимо трансаминаз, у Y. pestis обнаружены дезаминазы ряда аминокислот [Домарадский И. В., 1956] и декарбоксилаза аргинина. Наличие последней также важно для диагностики [Шиманюк Н. Я., 1972].

Показана способность чумного микроба превращать одни амнокислоты в другие, в частности орнитин в аргинин, аспартат в пролин, цистеин в метионин [Сучков Ю. Г. и др., 1971; Король В. В., 1973].

Все сказанное, вместе с независимостью от азотистых оснований и дополнительных факторов роста9, объясняет относительную неприхотливость чумного микроба к питательным средам. Однако её степень во многом зависит от происхождения штаммов, что было подмечено нами [Домарадский И. В., 1956] и стало общепризнанным в результате работ И. Л. Мартиневского [1969]. В качестве примера связи потребности в аминокислотах с происхождением штаммов можно сослаться на данные, приведенные в табл. 13.

Из других азотистых соединений внимания заслуживает мочевина, отношение к которой давно уже помогает отличать чумной микроб от возбудителя псевдотуберкулеза. Правда, сомнения в надежности этого теста были посеяны Г. Н. Ленской [1944] и Е. Е. Пунским [1960], что было связано с несовершенством тогдашней методики определения уреазы, однако после специальных исследований нескольких сонен штаммов разного происхождения неспособность чумного микроба гидролизовать мочевину была признана непреложной истиной.

 

3.4. Вопросы таксономии

 

Как видно из приведенных выше фактов, по некоторым признакам одни штаммы чумного микроба отличаются от других, что с легкой руки R. Devignat [цит. по Pollitzer R., 1954] и В. М. Туманского [1958] послужило основанием для постулата о внутривидовой неоднородности чумного микроба. Исходя из этого постулата, одна за другой стали появляться схемы соответствующих классификаций, например Л. Н. Классовского и В. С. Петрова [1970], Л. А. Пейсахиса и В. М. Степанова, [1975], Л. А. Тимофеевой и А. И. Логачёва [1975], построенные в общем по одному принципу? на признании зависимости особенностей штаммов от видовой принадлежности носителя возбудителя чумы ("зоологическая" классификация). Это привело к тому, что в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба была принята единая "систематическая схема подвидовых категорий для возбудителя чумы, о чём было сделано уведомление в Национальный центр по таксономии бактерий" [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992]. "Универсальная" схема для определения подвидов чумного микроба, основанная на результатах определения коэффициентов подобия (S) между различными штаммами, отражена в табл. 13. Эта схема полнее, нежели другие, и удобнее для практики.

Наше отношение к подобным классификациям сформировалось более 25 лет назад и с тех пор не изменилось [Домарадский И. В., 1971]. Мы по-прежнему считаем, что известные теперь различия между штаммами не могут служить достаточно веским аргументом в пользу существования подвидов чумного микроба. Мы не понимаем, почему не признать наличие вариаций ("биоваров" или "биотипов"), как это сделано, например, в случае Y. enterocolitica?

Следует также подчеркнуть, что все известные нам схемы внутривидовой классификации штаммов чумного микроба построены на результатах изучения штаммов из природных очагов СНГ и поэтому являются узкими, "национальными". К их составлению совершенно не привлекаются данные о штаммах из зарубежных природных очагов. Мы не исключаем, что, если следовать логике отечественных исследователей, то в таком случае число "подвидов" увеличилось бы в несколько раз!

И еще одно замечание. Делению на подвиды придают у нас такое большое значение, поскольку оно якобы позволяет внести больше ясности в проблему изучения природных очагов чумы и наметить "правильные пути "для их ликвидации [Туманский В. М., 1958]. Но ведь независимо от вида носителя и географической зоны выделения возбудителя чумы к ликвидации её очагов нужно стремиться всегда (мы имеем в виду не природный очаг, а очаг непосредствнного заражения людей). При этом важно не то, ферментирует ли микроб глицерин и восстанавливает нитраты, а в какой мере он способен вызывать чуму. Насколько нам известно, эпидемии чумы вызывали все (кроме полёвочьей?) "разновидности" чумного микроба, но отличия между ними определялись отнюдь не подобными признаками штаммов. Добавим, что в одних и тех же природных очагах могут циркулировать разные штаммы, а при пассажах через организм соответствующих видов грызунов одна "разновидность" может превращаться в другую.

Наконец, отметим, что многие систематики животных давно уже избегают пользоваться понятием "разновидность" [ Ралль Ю. М., 1965; Завадский К. М., 1968]. Пора это сделать и микробиологам!

Как полную противоположность только что сказанному и противоречащую здравому смыслу, надо расценивать попытку H. Berсovier и соавт. [1980] объединить два вида (Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (в один (Y. pseudotuberculosis, и подразделить его на два подвида: Y. pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis и Y. pseudotuberculosis subsp. pestis. К счастью, эта попытка большинством учёных была отвергнута.

Поскольку речь идёт о таксономии, нельзя обойти молчанием навязший на зубах вопрос о переходе одного вида микроба в другой. Мы имеем в виду высказывание А. И. Дятлова [1989] о "...возникновении чумного микроба из родственных ему сапрофитических форм в наше время, перед каждым случаем активизации очаговости чумы на каком-либо из участков очага после многолетних периодов отсутствия там эпизоотий". Как видно, А. И. Дятлов пошёл дальше авторов теории превращения чумного микроба в псевдотуберкулёзный [Ленская Г. Н., 1951; Жуков-Вережников Н. Н., 1957] и наоборот, псевдотуберкулёзного в чумной микроб. [Blanc G., Mollaret H., 1962]!

 

3.5. Генетика

 

3.5.1. Конъюгация

 

Поиски половой дифференциации у возбудителя чумы начались вскоре после выхода в свет книги Ф. Жакоба и Э. Вольмана [1962]. Однако очень быстро стало ясно, что собственного полового фактора типа F-плазмиды кишечной палочки ни у чумного микроба, ни у других иерсиний нет. Соответствующие данные можно найти в литературе [Домарадский И. В. и др., 1974]. Поэтому внимание исследователей быстро переключилось на изучение возможности придания иерсиниям способности к конъюгации за счёт чужеродных плазмид, обладающих Tra опероном. Тут первыми успеха добились S. Martin и F. Jacob [1962], которые сумели передать чумному микробу плазмиду F(lac Escherichia coli, получив Lac клоны. Позднее О. А. Проценко и П. И. Анисимов [1968, 1969] дополнили характеристику фенотипического выражения этой плазмиды в чумном микробе данными об образовании его рекомбинантами специфических пилей и об участии в гидролизе лактозы индуцибельной (как у E. coli) (-галактозидазы. Аналогичные результаты были получены на возбудителе псевдотуберкулёза. После этого начались попытки использования F(lac и F(cml штаммов обоих микроорганизмов для картирования их хромосом [Проценко О. А., 1970; Lawton W. D. et al., 1968]. Однако по ряду причин результаты не оправдали надежд и, насколько нам известно, к этому больше не возвращались, о чём можно только сожалеть. Дело в том, что в свое время в Ростовском противочумном институте был апробирован другой подход к решению указанной проблемы, основанный на принципе "специфического" мутагенеза, т. е. на получении желаемых мутантов при действии на синхронизирванные клетки специально подобранных агентов. В результате исследований удалось определить последовательность расположения на хромосоме штамма EV ряда локусов [Домарадский И. В. и др., 1974]. Впрочем у авторов не было уверенности в том, что в их опытах всегда имели место прямые, а не супрессорные мутации, и как раз в этом-то могла бы помочь разобраться конъюгация, опосредованная F-плазмидами.

Весьма примечательно, что одним из последствий приобретения чумным микробом F(-плазмид была обратимая утрата им вирулентности [Zsigray R. et al, 1983, 1985].

Вторым типом гетерологичных конъюгативных плазмид, которые переносились в клетки иерсиний и придавали им свойства доноров генетической информации, оказались R-факторы кишечной палочки [Ginosa R. S., MatneyT. S., 1963; Knapp W., Lebek G., 1967]. Однако частоты передачи различных R-факторов и экспрессии в чумном микробе соответствующих генов резистентности колебались в значительных пределах [подробнее см.? Домарадский И. В. и др.,1974].

Важно подчеркнуть, что собственных плазмид множественной лекарственной резистентности у чумного микроба нет. Одна из причин этого может заключаться в том, что чума относится к числу кровяных инфекций с трансмиссивным механизмом передачи. Именно эти два обстоятельства позволяют чумному микробу избежать контакта с основным резервуаром R-плазмид в природе (кишечными бактериями. В какой-то мере подобное объяснение подтверждается находками R-плазмид у Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica [Дроздов А. В. и др., 1992; Bechtel J., Boring J. R., 1979], заражение которыми происходит per os. Впрочем это можно объяснить и другой причиной (наличием у иерсиний мощной системы рестрикции/модификации, препятствующей проникновению в клетки чужеродной генетической информации и обусловливающей быструю её элиминацию [Cornelis G., Colson C. 1975]. Весьма вероятно, что поэтому даже у псевдотуберкулёзного микроба и возбудителя кишечных иерсиниозов R-плазмиды встречаются очень редко. Так или иначе, но открытие возможности передачи чумному микробу R-плазмид сыграло большую роль в изучении его генетики и имеет практическое значение. В частности, R-плазмиды были использованы для конструирования одного из вариантов вакцинного штамма (см. ниже), получения полирезистентнных вирулентных штаммов для испытания эффективности различных схем лечения чумы и для передачи чумному микробу от Y. pseudotuberculosis генов, ответственных за ферментацию раффинозы [Домарадский и др., а. с. СССР, № 3107970 от 14.04.81].

 

3.5.2. Трансформация

 

На основании результатов многих исследований было сделано однозначное заключение об отсутствии у чумного микроба естественной компетентности для восприятия как гомо-, так и гетерологичной ДНК. В то же время удалось показать, что у клеток чумного микроба (и других иерсиний) её можно искусственно вызывать, но только для плазмидных и фаговых ДНК. Эффективность такой трансформаци (трансфекции) достаточно велика и открывает широкие возможности для генно-инженерных манипуляций с иерсиниями. Приоритет в соответствующих разработках принадлежит автору настоящей монографии и его коллегам из ВНИИ биосинтеза белковых веществ [а. с. СССР № 2253466/0003/003 от 27.07. 78 г.; № 152324 от 19.07.79 г.; № 3047626 от 21.05.80 г. и др.], хотя об этом мало кто знает. Чтобы у читателя не возникло недоумение, предлагаем его вниманию очерки, в которых описаны причины подобной ситуации10.

 

3.5.3. Бактериофагия и трансдукция

 

Бактериофаги, лизирующие чумной микроб, многократно выделяли из фильтратов бульонных культур, от животных и блох, из почвы нор и сточных вод, причём в местах, где чумы давно не было [Pollitzer R., 1954]. В то же время, чумной микроб чувствителен к ряду фагов кишечной палочки и других бактерий. Сопоставление этих фактов вынудило Н. Н. Новосельцева и соавт. [1982] поставить вопрос: существуют ли "чумные" фаги на самом деле или приходится иметь дело с "кишечными" фагами, которые легко адаптируются к чумному микробу? Так или иначе, но фаги, пригодные для идентификации чумного микроба все же есть (например, фаги Д(Эреля, Покровской, Лариной), хотя их специфичность оставляет желать лучшего. Так, по данным Г. Г. Гурлевой [1959], помимо чумного микроба отдельные фаги, могут лизировать штаммы возбудителя псевдотуберкулёза, ряда видов кишечных бактерий и даже микрококков. В то же время чувствительность Y. pestis к чужеродным фагам при эпизоотологических обследованиях заставляет прибегать к помощи антифаговых сывороток (очевидно, они столь же неспецифичны, как и чумные фаги, которые используются для их получения).

Еще больше запутан вопрос об умеренных фагах и лизогении у чумного микроба. Некоторые авторы, например, О. П. Плотников и соавт. [1982], несмотря на возражения [Домарадский И. В. и др., 1974; Новосельцев Н. Н. и др., 1977], продолжают утверждать, что чумные умеренные фаги существуют, хотя единственным доказательством в пользу этого служат особенности морфологии негативных колоний и способность "лизогенизированных" культур продуцировать фаг. Однако постоянное образование фага присуще также псевдолизогенным культурам, что в случае Y. pestis показано Б. Н. Мишанькиным и Ю. Г. Сучковым [1973], а сама по себе морфология негативных колоний является слишком спорным признаком. В общем, мы по-прежнему придерживаемся мнения, что лизогении у чумного микроба нет, чем он отличается от Y. enterocolitica и других иерсиний [Домарадский И. В., 1971; Calvo С., Brault J., 1983].

Почти 20 лет назад я с коллегами из ВНИИ биосинтеза белковых веществ занялся поисками гетерологичных фагов для передачи генов чумному микробу, т. е. для трансдукции. Теоретическим обоснованием этого послужили данные о неабсолютой специфичности многих фагов [Амиров Э. Я., Домарадский И. В., 1981]. В конечном итоге, мы остановились на общетрансдуцирующем фаге Р1; выбор был предопределен, в частности, результатами опытов D. A. Smith и T. Burrows [1962], выявившими общие рецепторы фага Р1 у кишечной палочки и чумного микроба. Вскоре выяснилось, что фаги Р1 (Р1vir и P1сlr) пригодны для наших целей (их применение оказалось весьма эффективным средством трансдукции. С помощью фагов Р1 от кишечной палочки чумному микробу были переданы различные плазмиды, в том числе неконъюгативные или те, которые нельзя было передать с помощью конъюгации из-за явления поверхностного исключения, хромосомные гены [а. с. СССР "Метка" № 2251932/0001/001 от 15.02.1978 г.], а также фаг лямбда, маркированный транспозоном [а. с. СССР № 2269917/0005/005 от 1.09.78 г.]. Ныне предложенный нами принцип трансдукции широко применяют другие авторы, как в России, так и за рубежом.

 

3.5.4. Аутохтонные плазмиды

 

Косвенные указания на наличие собственных плазмид у чумного микроба были получены Е. Г. Кольцовой [1970], которой впервые удалась передача кишечной палочке пестициногенности от чумного микроба. Однако поиски их были заторможены утверждением R. Little и R. Brubaker [1972] о том, что чумной микроб плазмид не имеет. Тем не менее совместно с сотрудниками Кировского НИИЭГ, я все же продолжил соответствующие исследования. В моей лаборатории работали с вакцинными штаммами EV, 1 и 17, применяя для анализа ДНК электронную микроскопию, а в НИИЭГ использовали также вирулентные штаммы, а ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. В результате совместных усилий плазмиды были обнаружены. Более того, удалось установить связь патогенности (вирулентности) чумного микроба с плазмидами, что нашло отражение в формуле открытия [диплом на открытие "Плазма" № 001 от 27.06.83 г. с приоритетом от 27.12.77 г., неопубликовано]. С тех пор факт наличия плазмид у чумного микроба и их связь с вирулентностью стали непреложной истиной. Заметим, что за рубежом первые подтверждения этого стали появляться только с 1980-1981 гг.

Сейчас у чумного микроба основными считаются три плазмиды, которые кодируют свойства, указаннные в табл.14 и подробно описанные в разделе 3.8. Вместе с тем начинают появляются данные о наличии у чумного микроба других плазмид, функции которых полностью еще не вскрыты [Butler T., 1983; Tsukano H. A. et al.,1986].

Из числа основных плазмид чумного микроба постоянным атрибутом вирулентных штаммов Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis. является только одна, мол. масса которой колеблется в пределах 45-47 мДа. [Portnoy D. A., Martinez R, 1985; Skurnik M., 1985; и др.]

Все известные плазмиды чумного микроба и близкородственных иерсиний относятся к неконъюгативным. Передача их возможна только за счёт мобилизации гетерологичными конъюгативными плазмидами [Кольцова T. Г., 1970] или трандукции [собственные данные; Wolf-Watz H. et al., 1985].

Плазмидам иерсиний посвящено множество литературных источников и поэтому анализировать все относящиеся к ним данные здесь нет возможности.

 

3.6. "Мышиный" токсин

 

По данным E. S. Baker и соавт. [1952], токсин чумного микроба входит в состав водорастворимых компонентов клетки, представляющих собой её поверхностные ("оболочечные") антигены; водонерастворимый же остаток клеток содержит "соматический" антиген, общий для микробов чумы и псевдотуберкулёза (Sch(tze H., 1932). Из водного экстракта клеток токсин может быть осажден при 55-67 %-концентрации сульфата аммония ("фракция II" или FII). Характерной особенностью этого токсина оказалось то, что он вызывал гибель белых мышей и крыс, но не морских свинок. Поэтому его назвали "мышиным". Однако прежде чем перейти к рассмотрению последнего укажем, что помимо токсина в водном экстракте клеток содержится также капсульный антиген, который осаждается при более низкой концентрации сульфата аммония и поэтому еще называется "фракцией I" или "FI" (см. раздел 3.8.3).

Мышиный токсин является белком, входящим в состав цитоплазматической мембраны. С помощью проточного электрофореза на бумаге он был разделен на два компонента? субъединицы А и В. Субъединица А имеет мол. массу 240 кДа, а субъединица В (120 кДа и содержит значительно меньше триптофана, чем субъединица А. В свою очередь, при обработке SDS обе субъединицы распадаются на полипептиды с мол. массами от 12 до 24 кДа, которые сохраняют токсичность. Обе субъединицы отличаются высоким содержанием дикарбоновых аминокислот и низким содержанием цистеина. Однако для сохранения токсичности остатки цистеина очень важны, равно как важны и остатки триптофана. Удельная активность субъединицы А выше, чем таковая субъединицы В [Montie T. S., Ajl S. J., 1970; Montie T. C., Montie D. B., 1973].

Подобно любому белку мышиный токсин обладает антигенными свойствами. Очищенный токсин, смешанный с адъювантом Фрейнда, вызывает у кроликов образование антитоксина, способного нейтрализовать токсин из вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба. Токсин сенсибилизирует танизированные эритроциты, которые в реакции гемагглютинации могут служить для определения уровня антитоксина в крови, и связывает комплемент. Очищеннный токсин не вступает в реакцию с антикапсульными сыворотками, а антитоксин не реагирует с FI [Warren J. et al., 1955]. Однако антитоксические сыворотки не предохраняют против чумы, а токсин нельзя превратить в настоящий анатоксин, хотя при соответствующей обработке он теряет токсичность и продолжает связываться со специфическими антителами. От таких истинных экзотоксинов, как, например, дифтерийный или столбнячный, мышиный токсин отличается еще двумя признаками. Во-первых, при его введении нет латентного периода (при надлежащей дозе действие проявляется сразу же), а, во-вторых, отсутствует прямая связь между вирулентностью и токсичностью культур. Кроме того, хотя в картине интоксикации, вызванной мышиным токсином, и много общего с картиной чумы [Домарадский И. В., 1966; Sch(r M., Meyer K.,1956; Cocking E.C. et al., 1960], все же некоторые симптомы чумной интоксикации очень сходны с симптомами интоксикации, вызываемой эндотоксинами (табл. 15). На основании всего сказанного, мы не согласны с теми, кто, подобно T. Butler [1983], мышиный токсин называет "экзотоксином".

Говоря о мышином токсине, нельзя не упомянуть о том, что некоторые авторы, например, О. А. Проценко и соавт. [1983], его генетический контроль связывают с плазмидой pFra, молекулярная масса которой лежит в пределах 61-65 мДа.

 

3.7. Эндотоксин

 

В течение многих лет выделить эндотоксин чумного микроба ("полный антиген", как его называли раньше) никому не удавалось. Во всяком случае это не удалось ни G. Girard [1941; цит. по Коробковой Е. И. и др., 1944], независимо от того, имел ли он дело с вирулентными или авирулентными штаммами, ни Е. И. Коробковой и соавт. [1944], которые исследовали как шероховатные, так и гладкие колонии чумного микроба. Как считает T. Butler [1983], возможная причина этого заключалась в наличии у чумного микроба толстой белковой капсулы (FI), которая при применявшихся тогда методах мешала выделению эндотоксина. Проблему удалось решить лишь а 1956 г., когда D. A. Davies для извлечения липополисахарида (ЛПС) чумного микроба использовал водно-фенольную экстракцию. Препарат был свободен от белка и нуклеиновых кислот и содержал глюкозу, глюкозамин, альдопентозу, на долю которой приходилась большая часть остатка полисахарида Позднее этот сахар был идентифицирован как L- глицероманнопентоза [Foster A. B. et al, 1958] Химическое сходство ЛПС чумного микроба и ЛПС кишечной палочки было установлено D. S. Ellewood [1968], идентифицировавшим 3-дезокси-D-маннооктулозу (КДО) в составе ядра ЛПС чумного микроба.

Липидная часть ЛПС чумного микроба была изучена R. V. Walker и соавт. [1966]. После щелочного гидролиза ЛПС с помощью тонкослойной хроматографии было выявлено кефалиноподобное пятно, напоминающее фосфатидилэтаноламин. Позднее J. L. Hartley и соавт. [1974] выявили липид А в чумном ЛПС, который подобно липидым компонентам других ЛПС обусловливает их токсичность. В состав чумного липида А входят глюкозамин, глюкозамин-6-фосфат, этаноламин и одна важная жирная кислота ((-оксимиристиловая. Как полагают авторы, структура ЛПС чумного микроба несколько проще структуры других ЛПС, вследствие преобладания в ней (-оксимиристиловой кислоты над другими жирными кислотами.

Через 10 лет N. D. Venezia и соавт. [1985] вернулись к изучению липида А чумного микроба и точнее определили его состав у штамма EV40. Оказалось, что этот липид содержит связанные (-гликозидными (1R6) связями остатки D-глюкозамина, которые несут по две фосфатные группы. Различными методами показано, что остатки фосфатной кислоты соединены с 4-аминоарабинозильными остатками, а гликозидные фосфатные группы? с D- арабинозофуранозильным остатком в ЛПС II и с фосфорилэтаноламином в ЛПС I. Гидроксильные группы дисахарида ацилированы додедекановой, гексадеценоевой, 3-окситетрадекановой и 3-додеканоилокситетрадекановой кислотами. Аминогруппы дисахарида несут 3-окситетрадекановую и 3-додеканоилокситетрадекановую кислоты. Кроме того, меньшие количества 3-тетрадеканоил-окситетрадекановой и 3-гексадеканоилокситетрадекановой кислот связаны эфирными связями.

Нативный ЛПС чумного микроба сильно агрегирован и поэтому трудно определить его молекулярную массу. При ультрацентрифугировании он седиментирует при 29500 rpm, а под электронным микроскопом выглядит как нитевидная структура с диаметром около 8 нм.

 

3.8. Факторы вирулентности

 

В противоположность токсинам, постоянным структурным компонентам клетки чумного микроба, его видовым атрибутам, факторы вирулентности относятся к числу фенотипических признаков, которые начинают проявляться в инкубационном периоде и достигают "расцвета" в разгар болезни [Butler T., 1983]. Здесь необходимо подчеркнуть, что хотя большая часть известных сейчас детерминантов вирулентности чумного микроба присуща также Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, их экспрессия осуществляется по своим, характерным для каждой иерсинии, законам. Учитывая сказанное, легко понять, почему, например, чумной микроб и его "двойник" (Y. pseudotuberculosis, вызывают столь непохожие заболевания.

Считаю по-прежнему [Домарадский И. В. 1966], что основное отличие авирулентных штаммов