В зависимости от типа взаимодействия различают вирулент­ные и умеренные бактериофаги.

Фаг оказался очень полезным вирусом для лечения и профилактики многих инфекционных заболеваний человека и животных, вызываемых бактериями. После работ д'Эрреля фаг стал широко применяться для этих целей. Хорошие результаты были получены при лечении гнойных ранений, газовой гангрены и других заболевании во время Великой Отечественной войны. Но затем с появлением антибиотиков применение фага сократилось, так как лечение антибиотиками оказалось более эффективным и действие их lie имеет такой узкой специфичности.

При помощи заведомо известного фага, всегда имеющегося в лаборатории, определяют вид культуры бактерий, выделенной от

больного или из внешней среды, что очень важно для диагностики.

Кроме того, определением выделенных культур при помощи узких

типовых фагов можно установить источник инфекционных заболевании, что важно для принятия противоэпидемических мер. Нал и ч и е фага кишечной палочки и тем более фагов возбудителей кишечных инфекций в питьевой воде сигнализирует о неблагополучии санитарно-эпидемиологического состояния водоисточников,

бактериальном их загрязнении. Но фаги нередко приносят большой вред в производствах, основанных на жизнедеятельности микробов — бактерий или актиномицетов, а именно: в сырном производстве, в производстве антибиотиков, вакцин, бактериальных удобрений. На этих производствах па оборудовании, во внешней среде, в заводских помещениях, в сырье всегда в огромном количестве имеются соответствующие микробы.

Если производственные культуры, например, молочный стрептококк в производстве сыра или лучистый гриб в производстве стрептомицина, будут заражены соответствующим фагом, то, производство сыра пли антибиотика не сможет идти нормально. Поражение фагом производственных культур ведет к ослаблению производственного процесса вплоть до полной его остановки. Борьба с фагом в этих случаях бывает очень тяжелой. Необходимо тщательное обеззараживание всего процесса производства. Производственные культуры все время должны проверяться на отсутствие в них соответствующего фага. Необходимо пользоваться фагоустойчивыми культурами.

В почве клубеньковые бактерии и азотобактер могут быть заражены фагами. Значительная концентрация этих фагов в почве задерживает развитие клубеньков на корнях бобовых растений и азотобактера в почве, что в некоторых случаях влияет на урожай..

В зависимости от типа взаимодействия различают вирулент­ные и умеренные бактериофаги.

1. Вирулентные бактериофаги взаимодейс­твуют с бактерией по продуктивному типу. Проникнув в бактерию, они репродуцируются с образованием 200—300 новых фаговых частиц и вызывают лизис бактерий. Взаимодействие бактериофага с бактерией напоминает взаимо­действие вирусов человека с клеткой хозяина. Специфическая адсорбция фагов на бактери­альной клетке происходит при наличии ком­плементарных рецепторов липопротеиновой или липополисахаридной природы в ее кле­точной стенке. На бактериях, лишенных кле­точной стенки (протопласты, сферопласты), бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют поло­вые пили бактерий.

Фаги, имеющие хвостовой отросток, при­крепляются к бактериальной клетке свобод­ным концом отростка (фибриллами, базальной пластинкой). Проникновение фаговой нуклеиновой кислоты в бактерию наиболее изучено у бактериофагов, имеющих отрос­ток с сокращающимся чехлом. В результате активации АТФ чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помо­щью лизоцима, растворяющего прилегающий фрагмент клеточной стенки, как бы просвер ливает оболочку клетки. При этом ДНК фа­га, содержащаяся в его головке, проходит в форме нити через канал хвостового стержня и инъецируется в клетку, а капсид фага остается снаружи бактерии.

Некоторые мелкие кубические фаги, спо­собные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через ка­нал этих пилей. ДНК нитевидных фагов про­ходит в бактерию вместе с одним из капсид-ных белков.

Инъецированная внутрь бактерии нукле­иновая кислота подавляет биосинтез компо­нентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки фага. Эти про­цессы схожи с репродукцией вирусов чело­века. После образования компонентов фага происходит самосборка частиц: сначала пус­тотелые капсиды головок заполняются нук­леиновой кислотой, затем сформированные головки соединяются с хвостовыми отростка­ми. В результате изменения внутриклеточного осмотического давления и действия фагового лизоцима происходит разрушение оболочки, лизис бактерии и выход фагов из нее. Весь литический цикл от адсорбции бактериофага на бактерии до его выхода из нее занимает 20-40 мин.

2. Умеренные бактериофаги в отличие от ви­рулентных взаимодействуют с чувствитель­ными бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага идет в той же последовательности, что и у ви­рулентных фагов, и заканчивается лизисом клетки. При интегративном типе взаимодейс­твия ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синх­ронно с геномом размножающейся бактерии, не вызывая ее лизиса. ДНК бактериофага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий — лизогенной. Такое сосуществование бактерии и умерен­ного бактериофага называется лизогенией (от греч. lysis — разложение, genea — происхож­дение). Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении передается по наследству потомкам.

Каким образом нуклеиновая кислота при­соединяется к бактериальной хромосоме?После проникновения в бактерию ДНК уме­ренного фага приобретает форму кольца, а затем интегрирует по типу кроссинговера в строго определенную гомологичную область хромосомы клетки.

Итак, при лизогении образование фагового потомства не происходит. В основе «сдер­живающего» механизма репродукции фагов лежит образование в бактерии специфическо­го репрессора — низкомолекулярного белка, подавляющего транскрипцию фаговых генов. Биосинтез репрессора детерминируется ге­нами профага. Наличием репрессора можно объяснить способность лизогенных бактерий приобретать иммунитет (невосприимчивость) к последующему заражению гомологичным или близкородственными фагами. Под им­мунитетом в данном случае понимается такое состояние бактерии, при котором исключа­ется процесс вегетативного размножения вы­шеуказанных фагов и лизис клетки. Однако термин «лизогения» отражает потенциальную возможность лизиса бактерии, содержащей профаг. Действительно, профаги некоторой части лизогенной культуры бактерий могут спонтанно (самопроизвольно) или направ­ленно под действием ряда физических или химических факторов дерепрессироваться, исключаться из хромосомы, переходить в ве­гетативное состояние. Этот процесс заканчи­вается продукцией фагов и лизисом бактерий. Частота спонтанного лизиса бактерий в лизогенных культурах невелика (10², 10~⁶), т. е. не захватывает все клетки, обладающие иммуни­тетом. Частоту лизиса бактерий можно значи­тельно увеличить, воздействуя на лизогенную культуру индуцирующими агентами (УФ-лучи, ионизирующее излучение, перекисные соеди­нения, митомицин С и др.). Сам же фено­мен воздействия, приводящий к инактивации репрессора, называется индукцией профага. Явление индукции используют в генной ин­женерии. Однако спонтанный лизис лизогенных культур может нанести вред микробиоло­гическому производству. Так, если микроорга­низмы — продуценты биологически активных веществ оказываются лизогенными, сущест­вует опасность перехода фага в вегетативное состояние, что приведет к лизису производс­твенного штамма этого микроба.

Геном профага может придавать бактерии новые, ранее отсутствовавшие у нее свойс­тва. Этот феномен изменения свойств мик­роорганизмов под влиянием профага получил название фаговой конверсии (от лат. conver-sio— превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохими­ческие, антигенные и другие свойства бакте­рий. Например, наличие профага в дифтерий­ной палочке обусловливает ее способность продуцировать дифтерийный экзотоксин.

Умеренные фаги могут быть дефектными, т. е. неспособными образовывать зрелые фа­говые частицы ни в естественных условиях, ни при индукции. Геном некоторых умеренных фагов (Р1) может находиться в цитоплазме бактериальной клетки в так называемой плаз-мидной форме, не включаясь в ее хромосому. Такого рода умеренные фаги используют в качестве векторов в генной инженерии.

Практическое применение фагов. Бактерио­фаги используют в лабораторной диагнос­тике инфекций при внутривидовой иденти­фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на­носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко­торый вызвал ее лизис (образование сте­рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова­ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми­ологическое маркирование). Выделение бак­терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследова­ния проводят при эпидемиологическом ана­лизе вспышек инфекционных болезней.

Фаги применяют также для лечения и про­филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонел-лезный, дизентерийный, синегнойный, ста­филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен­терально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии в качестве векторов для получе­ния рекомбинантных ДНК.

Качественный метод определения фагов E.coli. Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 "С втечение 10—15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чаш­ку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.

 

 

Количественный метод — определение титра фага по методу Грациа. Для постановки опыта предварительно: а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате; б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3—4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10~²—10~⁷ в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведе­ния фага (10~⁷) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выли­вают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 "С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10~⁶) с бактериями и полу­жидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем — из разведения 10~⁵. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37 *С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответст­вует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризую­щая концентрацию фага, называется его титром (табл. 5.3.1).

Определение спектра литического действия фага. Чашку с пи­тательным агаром делят на квад­раты по числу испытуемых бак­териальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю со­ответствующей бульонной куль­туры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. За­тем на каждый засеянный квад­рат петлей или пастеровской пи­петкой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточ­ной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплош­ной лизис бактерий или так на­зываемые стерильные пятна набактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.

Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульон­ную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают на чашке те квадраты, в кото­рых имеется сплошной лизис бактерий. Фаготип бактериаль­ной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис.

Определение лизогении. Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, последний будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через

1 сут инкубации при 37 "С образуются очаги лизиса — "сте­рильные" пятна. При отрицательном результате опыта иссле­дуемую бактериальную культуру предварительно подвергают УФ-облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте.