Реактиви. Реактив 1 – 2%-ний розчин Na2CO3 в 0,1 Н розчині NaOH;1. Для методу Лоурі: Реактив 1 – 2%-ний розчин Na2CO3 в 0,1 Н розчині NaOH; Реактив 2 – 0,5%-ний розчин CuSO4×5H2O в 1%-ному розчині двозамі-щеного Na-цитрату або К-тартрату; Реактив 3 – готується перед роботою: змішують 50 мл реактиву А та 1 мл реактиву Б. Придатний для використання протягом 2 діб; Реактив 4. Реактив Фоліна-Чокальтеу. 10 г Na2Wo4∙2H2O (перекриста-лізований) і 2,5 г Na2MoO4∙2H20 вміщують в круглодонну колбу на 200 - 250 мл, приливають 70 мл води і добре перемішують. До одержаного розчину додають 5 мл 85%-го розчину Н3РО4 і 10 мл концентрованої HCl (x.ч.). Колбу приєднують до зворотного холодильника з шліфом і кип'ятять протягом 10 годин. Потім в розчин додають 15 г Li2SO4, 5 мл води і одну краплю брому. Розчин перемішують і нагрівають для видалення брому. Потім охолоджують, доводять водою до 100 мл, фільтрують і разводять водою до одержання 1 н. розчину. Кислотність визначають титруванням разведенного в 10 разів реактиву 0,1 н. лугом в присутності фенолфталеїну. Після приготування зберігається в темній склянці довгий час. 2. Для методу Бредфорда: 100 мг кумассі розчиняють в 50 мл спирту і додають 100 мл ортофосфор-ної кислоти, доводять водою до об'єму 1л і фільтрують через бумажний фільтр. Чистий реактив Бредфорда має коричневий колір і синіє в присутності білку. Для побудови калібрувального графіку беруть бичий сироватковий альбумін (БСА). 3. Розчин білку невідомої концентрації.
Матеріали та обладнання ФЕК з довжиною хвилі 750 нм та 595 нм, кювети з довжиною оптичного шляху 5 мм та 1 мм, аналітичні ваги, мірні колби, штатив з 7 пробірками для кожної бригади, піпетки місткістю 0,1; 1,0 та 5,0 мл.
Загальні відомості Методи визначення концентрації білків. Білки це біологічно активні речовини, що відіграють ключову роль в життєдіяльності клітин живої матерії. До складу білків входять вуглець, водень, азот, кисень, сірка. В деяких білках присутні такі елементи як фосфор, залізо, цинк, мідь, молібден. Активні центри ферментів можуть мати кілька молекул рідкісних металів таких як ванадій. Білки мають велику молекулярну масу, але при кислотному гідролізі утворюють ряд простих, низькомолекулярних сполук, що відносяться до класу a-амінокислот. В білкових молекулах послідовно розташовані амінокислотні залишки ковалентно пов¢язані пептидними зв¢язками один з одним, утворюючи довгі нерозгалужені полімерні ланцюги. Пептидні зв¢язки утворюються в результаті вилучення молекули води з карбоксильної групи однієї амінокислоти і a -аміногрупи іншої (-СО-NН-). Такі полімерні молекули називаються поліпептидними ланцюгами і можуть мати сотні амінокислотних залишків. Молекула білку може складатися з одного або кількох поліпептидних ланцюгів. Кількісне визначення концентрації білків у розчині може бути проведене різними методами: 1. Визначення азоту (метод К¢єльдаля). Метод заснований на повному гідролізі молекули білку під дією сірчаної кислоти у присутності каталізатора. Метод вимагає великої кількості білку та значних затрат часу. 2. Амінокислотний аналіз (рис.7.1). Метод амінокислотного аналізу проводиться методом Високоефективної рідинної хроматографії і є найбільш швидким серед традиційних методів дослідження. Метод використовує внутрішні мічені стандарти для точнішого і достовірнішого кількісного аналізу. 3. Колориметричні методи. Колориметричні методи визначення загального білку засновані на кольорових реакціях білків з реактивами або на неспецифічному зв'язуванні білку з барвником. Досить прості у відтворенні, потребують невеликої кількості білку (Біуретовий метод, Біуретовий метод у модифікації Ярош, метод Лоурі, метод Бредфорда). 4. Спектрофотометричний метод заснований на здатності ароматичних амінокислот (триптофану, тирозину і фенілаланіну) поглинати ультрафіолетові промені при 280 нм. Вимірюючи величину оптичної щільності при цій довжині хвилі, знаходять кількість білку в розчині. Оскільки білки відрізняються за вмістом ароматичних амінокислот, їх поглинання в ультрафіолетовій області спектра может відрізнятися. 5. Флюориметричні та інші сучасні методи визначення загального білку (наприклад, полярографічний мікрометод або атомно-абсорбційний аналіз) мають високу чутливість і специфічність, але потребують спеціального обладнання та спеціальної кваліфікації для дослідника, що разом з високою вартістю високою вартістю визначення значно обмежує його використання.
Ми розглянули в Лабораторній роботі 3 методи визначення концентрації білку в розчині з біуретовим реактивом та з біуретовим реактивом в модифікації Ярош. В даній лабораорній роботі будуть розглянуті методи Лоурі та Бредфорда. Метод Лоурі є найпоширенішим з колориметричних методів кількісного визначення білків в розчині був представлений в 1951 році. Посилання на цей метод є найчастіше згадуваною науковою статтею. Метод Лоурі дає змогу виміряти інтенсивність забарвлення розчину, у якому одночасно здійснюються дві кольорові реакції на білок: реакція Фоліна - відновлення білками суміші фосфатно-вольфрамової та фосфатно-молібденової кислот - реактиву Фоліна з утворенням комплексного з'єднання синього кольору. Синє забарвлення, що виникає, в основному визначається реакцією фенольного реагенту з залишками амінокислоти Tyr, деякий вклад вносять інші амінокислоти Trp, His, Cys та пептидні зв¢язки. У реакції відновлення беруть участь комплексні з'єднання міді, що утворилися при взаємодії білку в лужному розчині мідного купоросу. Друга із згаданих реакцій не дуже специфічна, зате досить чутлива. Тому метод Лоурі дозволяє вести визначення білків у дуже розведених розчинах, де кількість їх виражається всього лише десятками мікрограмів. Інтенсивність забарвлення комплексів вимірюють на фотоелектроколори-метрі (ФЕК) в кюветі 5 мм при довжині хвилі при довжині хвилі 750 нм (червоний світлофільтр) або на спектрофотометрі. Ha розвиток забарвлення впливає велика кількість речовин: компоненти буферних систем, відновники, комплексоны (ЭДТА в концентрації 0, 5 мМ), детергенти (тритон X100 в концентрації 0,1 - 0,2 %), сірчанокислий амоній в концентрації 0,15 %, сахароза в концентрації 10 % та ін. У зв'язку з цим при побудові калібрувального графіку для визначення білку за методом Лоурі в розчинник для стандартного білку необхідно включати усі компоненти, що містяться в аналізованій пробі. B деяких випадках доцільне попереднє осадження білків з розчинів, наприклад трихлороцтовою кислотою або очищення білкових розчинів від низкомолекулярих компонентів шляхом діалізу або гель-фільтрації. Щоб уникнути випадкових помилок, що можуть виникнути в процесі вимірювання, рекомендується готувати 3-5 повторів кожної проби. При визначенні концентрації речовини в розчині слід визначати оптичну щільність досліджуваного розчину за калібрувальною кривою побудованою для даної сполуки. Метод характеризується високою чутливістю 5 - 100 мкг білку/мл. Метод Бредфорда - один з найбільш популярних колориметричних методів кількісного визначення білків в розчині. Запропонований біохіміком Бредфорд в 1976 року. Метод заснований на реакції барвника кумасси (Coomassie Brilliant Blue G - 250) з аргініном і гідрофобними амінокислотними залишками. Утворена форма має блакитне забарвлення з максимумом поглинання при 595 нм і прямо пропорційна концентрації білку, що міститься в розчині. Механізм зв'язування Coomassie полягає у взаємодії аніонної форми барвника з білком. Початковий кислий розчин Coomassie має максимум поглинання при довжині хвилі 465 нм. Після додавання до розчину білку аніонна форма барвника Coomassie взаємодіє з білком. В результаті зв'язування колір барвника з червонувато-коричневого стає блакитним. Зв'язування з білком здійснюється за рахунок електростатичної взаємодії сульфонільних груп барвника з амінокислотними залишками білку. Зв'язування Coomassie відбувається переважно з аргініновим залишком (Arg) і залишками гістидину (His), лізину (Lys), Тирозину (Tyr), триптофану (Trp) і фенілаланіну (Phe). В зв'язуванні барвника з білком приймають участь сили Вандер-Ваальса і гідрофобна взаємодія. Кількість зв'язків, що утворюються між Coomassie і білком, залежить від кількості позитивно заряджених груп, розташованих в молекулі білку. Метод використовується для розчинів з низькою концентрацією білку. Чутливість методу залежить від співвідношення концентрацій визначуваного білку і барвника: чим більше барвника, тим чутливіший метод. При постановці реакції Бредфорд використовують співвідношення об'єму реагенту до зразка рівне 50:1 (мінімально рекомендований об'єм відповідає 200 мкл реагенту і 4 мкл зразка). Вимір поглинання при 595 нм проводять в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 мм. Метод застосовується при концентрації білку в межах від 2 мкг/мл до 120 мкг/мл. У цих межах витримується лінійна залежність між величиною поглинання та концентрацією білку. Побудова калібрувальної кривої. Метод визначення концентрації білку по Брэдфорд, так само, як і метод Лоурі, вимагає побудови стандартної калібрувальної кривої перед виміром концентрації невідомого білку. Для побудови калібрувальної кривої для методу Лоуріу флакон, який містить 5 мг ліофілізованого бичачого сироваткового альбуміну (БСА) або γ-глобуліну, обережно додають 5 мл фізіологічного розчину NaCl (концентрація маточного розчину 1мг/1мл). Потім легкими обертальними рухами перемішують до повного розчинення. В окремих пробірках розводять маточний розчин для побудуви калібрувальної кривої як показано в таблиці (табл.7.1) Таблиця 7.1 Схема розведення БСА для побудови калібрувальної кривої за методом Лоурі
До 1 мл білкового розчину додають 4 мл суміші розчинів А и В. Струшують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі. Потім швидко доливають 0,4 мл реактиву Фоліна, енергійно перемішують і залишають на 30-90 хв для розвитку забарвлення. Жовте забарвлення розчину поступово переходить у синє. Оптичну щільність розчину вимірюють на фотоелектро-колориметрі при 750 нм (червоний світлофільтр), кювета 5 мм. За одержаними даними будують калібрувальну криву. Величину поглинання відкладають по осі ординат, а відповідну їй концентрацію білку в пробі по осі абсцис. Аналогічно будується калібрувальна крива для методу Бредфорда. Хід роботи Визначення невідомих концентрацій білкових розчинів. Метод Лоурі. Для аналізу беруть три пробірки на 10 мл (1-ша контроль, 2-га та 3-тя розчини білків невідомої концентрації). В дослідні пробірки вносять 0,4 мл розведеного в кілька разів розчину білку невідомої концентрації, а в контрольну – 0,4 мл фізіологічного розчину або води. У всі пробірки доливають по 2 мл реактиву 3, перемішують і залишають на 10 хвилин.Потім швидко доливають 0,2 мл реактиву 4, перемішують, витримують 30 - 40 хв. і вимірюють поглинання проти контрольної проби (1-ша пробірка, де замість білку додавали 0,4 мл води або фізіологічного р-ну) при 750 нм (червоний світлофільтр), кювета 5 мм. Вміст білку в розчинах невідомої концентрації знаходять за калібру-вальною кривою (рис.7.2). Для цього величину поглинання для кожної проби знаходять на осі ординат, з’єднують цю точку горизонтальною прямою з калібрувальною кривою і з точки перетину опускають перпендикуляр на вісь абсцис. Точка перетину перпендиуляра з віссю абсцис покаже вміст білку в пробі в мг/мл. Потім роблять перерахунок концентрації білку з урахуванням розведення. ΔD
0,1 0,2 0,3 концентрація білку, мг/мл
Рис. 7.2. Визначення концентрації білку за калібрувальною кривою Метод Бредфорда. Для аналізу беруть три пробірки на 10 мл (1-ша контроль, 2-га та 3-тя розчини білків невідомої концентрації). В дослідні пробірки вносять 0,5 мл розведеного в кілька разів розчину білку невідомої концентрації, а в контрольну – 0,5 мл фізіологічного розчину або води. В кожну пробірку додають 0,5 мл реагента і перемішують. Забарвлення розвивається протягом 5-30 хв. Вимірюють поглинання проти контрольної проби при 595 нм в кюветі 1 мм. Вміст білку знаходять за калібрувальною кривою побудованою для методу Бредфорда. При визначенні білку за даним методом потрібно пам'ятати, що реагент дуже чутливий до слідових кількостей білку (1-2 мг/мл). Посуд, фільтр, кювети для роботи повинні бути абсолютно чистими. Кювети після кожного вимірювання бажано мити спиртом, оскільки кумассі сорбується на склі, що завищує показання приладу. Завдання для виконання 1. Приготувати стандартний розчин альбуміну з концентрацією 100 мг/мл та приготувати з цього розчину робочі розчини (кожну концентрацію зробити в 3 повторах). 2. Виміряти оптичну густину в кожній пробірці проти контрольної проби за методом Лоурі та методом Бредфорда. Побудувати калібрувальну криву. 3. Кожна бригада одержує у лаборанта розчин білку невідомої концентрації. 4. Для визначення концентрацію білку в невідому розчині необхідно: а) приготувати 3 різних розведення білку (в 5, 10, 20 разів); б) виміряти об'єм розчину кожного розведення; в) визначити концентрацію білку в кожному розведенні методом Лоурі та методом Бредфорда; г) визначити кількість білку в мг для кожного розведення. 5. Порівняти значення одержані методом Лоурі та методом Бредфорда. 6. Написати висновок.
Контрольні запитання 1. Принцип методу визначення концентрації білку методом Лоурі. 2. Принцип методу визначення концентрації білку методом Бредфорда. 3. Як будується калібрувальна крива. 4. На чому засновано визначення концентрації розчинів за допомогою фотометричних методів аналізу? 5. Які фотометричні методи визначення концентрації забарвлених розчинів ви знаєте? 6. Який з вивчених методів є самим чутливим.
РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА 1. Пентин, Ю.А. Основы молекулярной спектроскопии/ Ю.А.Пентин. - М.: Мир, 2008.- 398 с. 2. Шмидт, В. Оптическая спектроскопия для химиков и биологов / В. Шмидт.- М.: Техносфера, 2007. - 368 с. 3. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера. В 3 т. / Д. Нельсон, М. Кокс. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 694 с. 4. Lowry, O.H., Rosebrough N.J., Farr A. L., Randall R.J. Рrotein measurement with the folin phenol reagent. - J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - Р. 265-275. 5. Bradford, M. M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.-Analytical Biochemistry. - 1976. - V.72. - P.248–254
|
