Занятие № 4

 

ТЕМА. СТРОЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ

СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Цель занятия: 1.Повторить материал по физико-химическим

свойствам белков.

2.Ознакомиться с современными представлениями о структу-

ре ферментов, изучить их характерные свойства.

Исходный уровень знаний:

- строение и физико-химические свойства белков;

- понятие о катализаторах.

Содержание занятия.

I.2. Понятие о катализе.

Химическая природа ферментов.

Свойства ферментов.

Строение ферментов (функциональные центры, их строение).

Факторы, определяющие активность ферментов.

Витамины как коферменты.

Понятие об изоферментах.

Мультимолекулярные ферментные системы.

 

II.1.Работа № 1.ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА

АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Принцип метода и химизм.

Амилаза слюны (a-1,4-гликозидаза) катализирует гидролиз a-1,4-гликозидной связи крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы с промежуточным образованием декстринов различного размера. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, амилодекстрины - фиолетовое, эритродекстрины - красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза - желтое (цвет водного раствора йода, т.е. окрашивания с йодом не дают). Конечные продукты гидролиза крахмала - мальтоза и глюкоза - имеют свободную альдегидную группу и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. При нагревании альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь гидрата окиси меди (голубого цвета) - восстанавливается в гидрат закиси меди (желтого цвета). При дальнейшем нагревании образуется красная закись меди:

H O

C=O + 2CuSO₄ + 5NaOН ® C–O–Na + 2CuOH + 2Na₂SO₄ + 2H₂O

R R

 

Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, т.е. чувствительность фермента к температуре. Для многих ферментов максимальная ферментативная скорость наблюдается при 38-40⁰C. Эта температура называется температурным оптимумом. При нагревании свыше 70⁰С они утрачивают свои свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. Замедление и прекращение ферментативной реакции происходит вследствие тепловой денатурации белковой молекулы фермента. При низких температурах ферменты не денатурируются, но скорость реакции резко снижается за счет снижения кинетической энергии молекул. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции.

Порядок выполнения работы:

В чистую пробирку собрать примерно 2 мл нативной (неразведенной) слюны и кипятить в течение 5 минут, охладить.

 

Реагенты (кап.)	Пробирки
1-я	2-я	3-я
1% раствор крахмала
Нативная слюна, разведенная в 10 раз		-	-
Прокипяченная неразведенная слюна	-		-
Дистиллированная вода	-	-
Поместить в термостат при 380С на 10 мин. Из содержимого каждой пробирки отлить по 5 капель в дополнительные пробирки. а) йодная проба (на крахмал)
Реагенты (кап.)	Пробирки
1-а	2-а	3-а
Исследуемый раствор
Раствор йода в йодистом калии
РЕЗУЛЬТАТЫ:
б) реакция Троммера (на глюкозу и мальтозу)
Реагенты (кап.)	1-б	2-б	3-б
Исследуемый раствор
10% раствор NаОН
1% раствор CuSO4
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

 

Работа № 2. ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИИ СРЕДЫ НА АКТИВ-

НОСТЬ ФЕРМЕНТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ОПТИМУМА рН

Принцип метода и химизм.

Для разных ферментов существует свой оптимум рН среды, когда фермент наиболее активен. Например, оптимум рН пепсина (фермент желудочного сока) - 1,5-2,0; аргиназы (фермент печени) - 9,5. Для амилазы слюны оптимум рН - 6,8-7.2; в кислой и щелочной среде активность ее снижается за счет взаимодействия белковой молекулы с ионами раствора.

Химизм реакции см. выше (раб. N1).

Порядок выполнения работы:

Слюну развести в 10 раз. Взять 5 пробирок и приготовить смеси в соответствии с таблицей (все растворы берутся в каплях).

Реактивы	Пробирки
1	2	3	4	5
раствор 1
раствор 2
1% раствор NaCl
рН	5,8	6,9	7,4	7,9	8,5
0,5% раствор крахмала
Слюна разведенная
Перемешать, поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут
раствор йода
Окраска
Продукты гидролиза крахмала

ВЫВОД:

 

Работа № 3. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ

АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Принцип метода.

Ферменты обладают специфичностью, т.к. способны катализировать только определённые химические реакции. Специфичность действия ферментов бывает абсолютная, относительная и стереохимическая. Она определяется тем, что только некоторые строго определённые функциональные группы, входящие в состав ферментов, могут участвовать в образовании фермент-субстратных комплексов.

Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов, не оказывая действия на дисахариды. Мальтаза слюны ускоряет гидролиз образующегося дисахарида мальтозы и не оказывает действия на сахарозу.

Химизм реакции см. в работе N 1.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.)	1-я пробирка	2-я пробирка
Слюна, разведенная 1:5
1% раствор крахмала		-
1% раствор сахарозы	-
Поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут
Реактив Фелинга
Нагреть до кипения и кипятить 1 мин
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

 

 

III.2. Контрольные вопросы.

Как и почему активность ферментов зависит от температуры?

Что такое температурный оптимум ферментов?

Как и почему активность ферментов зависит от рН среды

(график)?

Какие ферменты активны в кислой; нейтральной;

щелочной среде?

Что такое специфичность ферментов?

Какие виды специфичности ферментов Вы знаете?

Примеры.

Укажите качественную реакцию на крахмал.

 

Материал для самоподготовки: I а) 1. с.44-49, 114-129,

139-143; II; III.