ВЫДЕЛЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ГРУПП БАКТЕРИЙ
Выделение культур актиномицетов Источником для выделения актиномицетов является почва. Почвенную суспензию увлажняют, растирают (как описано ранее), и готовят взвесь в стерильной воде. Высев производят на среду следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 20, КNО3 - 1 К2НРО4 - 0,5, MgSO4 x 7Н 2O - 0,5, NaCl - 0,5, FeSO4 - следы, вода водопроводная, рН 7,2-7,3. После появления колоний отбирают 2-3 изолированные, рассевают и инкубируют при 28 о С. Микроскопируют и описывают отдельные клетки и сформировавшиеся колонии. Выделение бактерий рода Bdellovibrio Источником для выделения служит почва. 10 г почвенного образца смешивают с 10 мл воды (водопроводной) и встряхивают в течение I часа. После того, как взвесь отстоялась, ее центрифугируют для удаления крупных частиц и последовательно фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор до 0,45 мкм. 0,5 мл профильтрованной суспензии вносят в пробирку с 3 мл полноценного агара (0,7%). В пробирку вносят культуру бактерий хозяев (Pseudomonas, Erwinia, Escherichia и др.) и выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% агаром. После инкубирования в течение 18 часов, отмечают появление негативных колоний. Если колоний не возникает, то инкубирование продолжают еще сутки. Возникающие после инкубирования в течение 2 суток колонии рассматривают как бделловибрионы. Пассируют (т.е. вырезают кусочки агара и ресуспендируют в стерильной воде), а затем наслаивают на газон бактерий-хозяев не менее 3 раз. Получение культур мезофильных спорооборазующих бактерий Готовят пробы из образцов почвы как описано ранее. Затем 0,1 мл исследуемого образца добавляют к 9 мл полноценной среды, подогревают 15 мин при 70°С, инкубируют в течение ночи. Затем выросшие культуры высевают на полноценную агаризованную среду. Для выделения культур Clostridium используют среду следующего состава (г/л): КН2РО4 - 0,5, К2НРО4 - 0,5, MgS04 - 0,5, NaCl – 0,5, вода водопроводная, глюкоза - 20, пептон - 5, CaCO3 - 10, рН 7,0. Выделение анаэробных микроорганизмов рода Clostridium Для выделения анаэробов используют образцы почвы, приготовленные как описано ранее. Посев осуществляется в среду, содержащую (г/л): КН2РО4 - 0,5, К2НРО4 - 0,5, MgS04 - 0,5, NaCl – 0,5, вода водопроводная, глюкоза - 20, пептон - 5, CaCO3 - 10, рН 7,0. При выращивании в высоком слое среды, ее наливают не менее чем на 2/3 в пробирки, стерилизуют, остужают и делают засев образца. На поверхность наносят слой вазелинового масла. Инкубируют при 37° С. В качестве восстановителя используют 0,05 % тиогликолевую кислоту или цистеин НС1 (0,025 %). Вышеуказанная среда может быть уплотнена внесением 0,2% агара, проавтоклавирована в пробирках и охлаждена до 45о С. На дно первой пробирки вносят 0,1 мл образца, перемешивают и 0,1 мл переносят на дно следующей пробирки и т.д. Пробирки быстро охлаждают в холодной воде. Рост Clostridium обусловливает золотисто-желтую флуоресценцию. Выделение микроорганизмов, растворяющих фосфаты кальция Указанные микроорганизмы выделяют из почвенной суспензии путем высева 10-4 –10-6 разведений на агаризованную среду следующего состава (г/л): глюкоза - 10, аспарагин - I, К2SО4 - 0,2, МgSО4 x 7H2O -0,2 дрожжевой экстракт - 0,02, агар - 15., вода водопроводная, стерилизуют 15 мин при 0,5 атм. Фосфат кальция вносят методом осаждения следующим образом: в стерильную расплавленную среду (на 100 мл) вносят 0,33 г СаС12 х 6Н20, после его растворения добавляют 0,38 г Nа3РО4 x 12Н2О. Образуется примерно 0,15 г Сa3(PO4)2. Инкубируют 2-7 суток при 28-30°С. Выделение культур микобактерий Для получения накопительной культуры готовят среду следующего состава (г/л): NН4С1 - 0,5, К2НРО4 - 0,5, МgSO4 - 0,2, СаСО3 - 0,2, вода водопроводная. Стерилизуют 20 мин при 0,5 атм, разливают в конические колбы слоем по 1,5-2 см. В среду стерильной пипеткой вносят по каплям парафин. Среду заражают небольшим количеством почвы. Инкубируют 2 недели при 28-30о С. Вокруг капель парафина образуются скопления микобактерий. Диск парафина переносят на предметное стекло, петлей снимают часть клеток и пересевают. Исследуют кислотоустойчивость клеток. Выделение азотфиксирующих микроорганизмов Для выделения азотфиксирующих микроорганизмов используют жидкую безазотистую среду Эшби, которой засевают в колбах на 250 мл примерно 2-3 г парниковой почвы. Колбы помещают в термостат на 28-30°С. Через 5-7 суток инкубирования на поверхности среды образуется пленка, что может свидетельствовать о накоплении азотобактера. В случае вспенивания предполагают наличие Clostridium и исследуют образование масляной кислоты. 5 мл жидкости из колбы переносят в пробирку и добавляют 10% раствор FeCl3 (2 мл), нагревают до кипения. Раствор маслянокислого железа, который образуется, имеет кроваво-красный цвет. Кроме того, готовят мазки и окрашивают их (с поверхности пленки и из нижних слоев), Выделение культур лактобацилл Для выделения культур лактобацилл из сыров делают штрихом посев из разведений на среду следующего состава (г/л): гидролизат казеина - 10, мясной экстракт - 10, дрожжевой экстракт - 5, глюкоза - 20, ацетат натрия - 5, цитрат аммония - 2, К2НРО4 - 2, МgSO4 -0,2, MnCl2 x 4H2O -0,05, вода дистиллированная. Для выделения гомоферментативных молочнокислых бактерий используют стерильное обезжиренное молоко 10 %. Для выделения гетероферментативных молочнокислых бактерий используют молоко с добавлением лимоннокислого натрия (1 %) или дрожжевого автолизата (2 %) и глюкозы (1 %).Температуру инкубирования выбирают в зависимости от вида бактерий которые нужно выделить: 30о С для - мезофильных, 45о С – для термофильных культур и 25о С – для выделения Lactococcus lactis subsp .cremoris. Изолированные колонии лактококков получают на агаризованной среде при глубинном засеве из ряда разведений.
Приложение Таблица 1
|
