Лабораторная работа. Определение содержания углеводов методом тонкослойной хроматографии

 

Цель работы:ознакомиться с методом тонкослойной хроматографии углеводов.

Принцип метода. При проведении хроматографического разделения углеводов методом тонкослойной хроматографии пластинку с тонким слоем пористого носителя (например, пластинку SiluFol), на которую нанесены растворы углеводов, помещают в растворитель, который, продвигаясь за счет капиллярных сил, перемещает углевод. По завершению хроматографии проводят обработку пластинки, позволяющую выявить пятна углевода, и расчетным методом определяют массу углевода в исследуемом растворе.

Оборудование и реактивы:пластинки Silufol или SilufoI–UV, исследуемый (раствор меда) и стандартныйе (10 мкг в пробе) растворы углеводов (глюкозы, галактозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы), растворитель – смесь бутанол-ацетон-вода (4:5:1), в случае использования пластинок Silufol нафторезорциновый реактив (свежеприготовленная смесь равных объемов 20 %-го водного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,2 %-го спиртового раствора нафторезорцина). Микропипетки, пульверизатор в случае использования пластинок SilufoI или источник ультрафиолетового света в случае использования пластинок Silufol–UV, хроматографическая камера, линейка, простой карандаш, сушильный шкаф.

Ход работы. Ha пластинке на расстоянии 2 см от нижнего края (линия старта) аккуратно намечают карандашом три точки нанесения растворов углеводов. C помощью микропипетки в отмеченные места наносят равные объемы исследуемого раствора углевода (5–20 мкг в пробе), разбавленного исследуемого раствора углевода и стандартного раствора углевода таким образом, чтобы получить пятна одного диаметра. После высушивания пятен пластинку помещают в хроматографическую камеру, на дне которой находится растворитель – смесь бутанол – ацетон – вода (4: 5: 1). Высота слоя растворителя – 1 см. Хроматографию проводят до прохождения растворителем 10 см от линии старта. После этого хроматограмму высушивают и проявляют. При использовании пластинок Silufol хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором нафторезорцина и сушат в сушильном шкафу 5–10 мин при температуре 90–100 ºС для проявления пятен углевода. Пятна глюкозы и галактозы имеют сине–фиолетовый цвет, фруктозы – красно–черный, сахарозы и мальтозы — красный, лактозы — красно–фиолетовый, рамнозы – зеленый, ксилозы – светло–серый, манозы – светло–синий, арабинозы – сине–зеленый.

B случае использования пластинок Silufol–UV пятна углевода выявляют под ультрафиолетовым светом.

Определяют площадь пятен. Массу углевода в пробе исследуемого раствора (мкг) рассчитывают по формуле

,

где М_st – масса углевода в пробе стандартного раствора;

S_st, S, Sp – площади пятна стандарта; исследуемого раствора и разбавленного исследуемого раствора;

P – фактор разведения.

Оформление работы

Привести расчеты по приготовлению реактивов. Провести ТСХ углеводов, идентифицировать их и определить содержание в пробе.

Контрольные вопросы и задачи

1. В чем сущность тонкослойной хроматографии? Каковы преимущества тонкослойной хроматографии перед другими хроматографическими методами?

2. Что представляет собой неподвижная твердая фаза в ТСХ? Как она наносится на стеклянную или металлическую пластинку? Какие требования предъявляются к твердой фазе?

3. Какие растворители используются в ТСХ? Как осуществляется выбор растворителей?

4. Как характеризуются сорбционные свойства системы в ТСХ? Назовите известные виды ТСХ.

5. С какой целью используются в ТСХ «свидетели» (метчики)? Как осуществляется процесс тонкослойного хроматографирования? Как проявляется хроматограмма?

6. Как осуществляются в ТСХ количественные определения компонентов?

7.Дня количественного определения аминоуксусной кислоты в анализируемом образце использовали метод тонкослойной хроматографии. Для стандартных образцов получены следующие результаты:

Концентрация аминоуксусной кислоты, мкг/0,01 мл 5,0 10,0 15,0

Площадь пятна, мм² 14,1 23,6 36,2

Для построения калибровочного графика использована зависимость площади пятна от концентрации аминоуксусной кислоты. Навеску массой 1,008 г растворили в мерной колбе вместимостью 100 мл. Затем 0,01 мл раствора хроматографировали методом ТСХ и получили пятно площадью 18,6 мм2. Определите массовую долю аминоуксусной кислоты в анализируемой навеске.