ХРОМАТОГРАФИИХРОМАТОГРАФИЯ Хроматография [гр. сhrömatos – цвет + graphö – пишу] – метод разделения, анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. При этом разделяемые вещества распределяются между двумя несмешивающимися фазами (в зависимости от их относительной растворимости в каждой фазе): подвижной и неподвижной.
Хроматография один из наиболее распространенных физико-химических методов исследования. Хроматографические методы широко используются в химии и биохимии, находят применение в химической, нефтехимической, металлургической, фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности. С повышением экологических требований к среде обитания, продуктам питания, лекарствам естественно находят свое отражение в исследовании охраны окружающей среды и медицине, а также в других областях науки и промышленности. Круг решаемых задач и практическое использование хроматографии непрерывно расширяется.
СУЩНОСТЬ И КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИИ В основу той или иной классификации хроматографических методов могут быть положены различные характерные признаки процесса. При этом следует учитывать, что существуют промежуточные варианты, не укладывающиеся в рамки строгой классификации. Более того, именно такие промежуточные варианты часто оказываются весьма перспективными и даже единственно возможными для решения сложных задач анализа. Разнообразные варианты хроматографии укладываются в относительно простую схему классификации в зависимости от используемой подвижной фазы и характера межмолекулярных взаимодействий
Классификация вариантов хроматографии по фазовым состояниям:
Варианты хроматографии по характеру взаимодействий: По размеру молекул – ситовая За счет физической адсорбции или растворения – молекулярная За счет ионного обмена – ионообменная За счет водородных связей, химического сродства и др. – хемосорбционная В зависимости от способа перемещения сорбатов вдоль слоя сорбента различают: проявительный (элюационный), фронтальный, вытеснительный методы и электрохроматографию.
Варианты хроматографии по способу проведения процесса: В цилиндрическом слое сорбента – колоночная В слое сорбента на плоской поверхности – планарная В пленке жидкости или слое сорбента, размещенном на внутренней стенке трубки – капиллярная В полях электрических, магнитных, центробежных и других сил – хроматография в полях сил Проявительный (элюационный) метод заключается в том, что сорбаты переносятся через сорбционный слой потоком вещества (элюента), сорбирующегося хуже любого из сорбатов. В ходе проявительного анализа разделенные компоненты анализируемой смеси выходят из хроматографической колонки в потоке элюента отдельными зонами, между которыми (при достаточно четком разделении) из колонки выходит чистый элюент. Основные преимущества проявительного метода заключаются в следующем: 1) при выборе соответствующих условий компоненты могут быть, практически полностью, изолированы друг от друга и будут находиться лишь в смеси с элюентом; 2) сорбент непрерывно регенерируется элюентом, поэтому после выхода наиболее сильно сорбирующегося компонента пробы может быть немедленно начато исследование следующей смеси; 3) если концентрация исследуемого компонента соответствует линейному участку изотермы сорбции, то время элюирования компонента при заданных условиях является постоянной величиной, которая может быть использована для целей идентификации. К недостаткам метода относится необходимость использования начительных количеств элюента. Проявительный анализ можно проводить как при постоянной температуре (изотермическая хроматография), так и при изменении температуры сорбента в процессе анализа по заданной программе (хроматография с программированием температуры). В последнем случае изменяется сорбционная емкость сорбента. Фронтальный метод заключается в непрерывном пропускании исследуемой смеси через слой сорбента. При этом на сорбенте образуются зоны, содержащие последовательно увеличивающееся число компонентов, а из колонки вначале выходит порция наименее сорбирующегося вещества. Фронтальный анализ применялся на ранних стадиях развития хроматографии, когда еще не были достаточно разработаны методы детектирования. В настоящее время он используется редко и практически совсем не применяется для целей количественного анализа. Это объясняется тем, что при фронтальном анализе ни один из компонентов смеси не отделяется полностью от остальных. Если после полного проявления концентрационного профиля при фронтальном анализе прекратить подачу пробы и начать промывку колонки чистой подвижной фазой, то фронтальный анализ превратится в вариант проявительной хроматографии с очень большой пробой. Кривая элюирования будет повторять в обратном порядке кривую фронтального анализа; последняя ступень будет соответствовать относительно чистому последнему (наиболее сильно удерживаемому) компоненту. Вытеснительный метод заключается в переносе разделяемой смеси потоком вещества (вытеснителя), сорбирующегося сильнее любого из компонентов смеси. В ходе вытеснительного анализа образуются отдельные примыкающие друг к другу зоны компонентов, которые располагаются в порядке увеличения их сорбируемости. Порядок элюирования компонентов характеризует их физико-химические свойства, а ширина полосы (не высота!) пропорциональна концентрации данного компонента. Вытеснительный анализ как метод разделения имеет весьма ограниченное применение и крайне редко используется в количественном анализе. Это объясняется тем, что в результате описанного процесса не получается дискретных локальных полос индивидуальных соединений. Электрохроматография – хроматографический процесс, при котором движение заряженных частиц осуществляется под действием приложенного напряжения. Скорость движения частиц определяется их массой и зарядом. В зависимости от природы процесса, обусловливающего распределение сорбатов между подвижной и неподвижной фазами, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, осадочную, аффинную и эксклюзионную хроматографию. Элементарным актом в адсорбционной хроматографии является адсорбция; разделение основано на различии в адсорбируемости компонентов смеси на данном адсорбенте. В распределительной хроматографии – растворение; разделение основано на различии в растворимости сорбатов в подвижной и неподвижной фазах или на различии в стабильности образующихся комплексов. В ионообменной хроматографии – на различии констант ионообменного равновесия. В осадочной хроматографии – на различной растворимости осадков в подвижной фазе. В аффинной – на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом, ковалентно связанным с нерастворимым носителем. Лигандами могут выступать, например, ингибиторы, кофакторы, субстраты, а носителями – силикаты, полиалкиламиды, декстрины, целлюлоза, хитин, крахмал. В эксклюзионной хроматографии разделение основано на различии в проницаемости молекул разделяемых веществ в неподвижную фазу (в случае гель-хроматографии неподвижной фазой служит гель) и обусловлено размерами этих молекул. Компоненты элюируются в порядке уменьшения их молекулярной массы. К промежуточным методам относится хроматография на модифицированном сорбенте (газо-жидко-твердофазная), основанная на том, что неподвижной фазой служит твердый адсорбент, модифицированный небольшим количеством жидкости. В этом случае играют роль как адсорбция на поверхности газ–твердое тело (и, в определенной степени, – на поверхности жидкость–твердое тело), так и растворимость в жидкости. Существуют и другие промежуточные варианты. Жидкостная хроматография – хроматографический процесс, в котором подвижной фазой является жидкость. В жидкостно-жидкостной хроматографии и подвижной и неподвижной фазами являются жидкости. В жидкостно–адсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент, а подвижной – жидкость. В зависимости от цели проведения хроматографического процесса различают аналитическую, неаналитическую, препаративную и промышленную хроматографию. Аналитическая хроматография предназначена для определения качественного и количественного состава исследуемых смесей. Существуют два основных метода хроматографического определения состава смесей: 1) метод выходной кривой, основанный на непрерывном определении свойства выходящего из колонки потока как функции времени или объема пропущенного вещества; 2) метод слоя, заключающийся в определении изменения свойства смеси по длине сорбционного слоя. Неаналитическая хроматография – метод исследования физико-химических характеристик веществ при использовании хроматографической аппаратуры и на основании параметров хроматографических зон. Препаративную хроматографию применяют для выделения небольших количеств чистых компонентов в лабораторных условиях. Промышленную хроматографию используют для получения чистых веществ в значительных количествах. Разумеется, приведенная выше классификация хроматографических методов не может считаться исчерпывающей. Так в газовой хроматографии широкое распространение получили комплексные (гибридные) методы. Из них наиболее важными являются реакционная (реакторная) газовая хроматография (сочетание химических превращений и хроматографического процесса) и хромато−масс-спектрометрия (последовательное соединение хроматографической колонки и масс-спектрометра с получением полных или частичных масс-спектров для каждого из компонентов исследуемой смеси).
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Жидкостная хроматография – вид хроматографии, в которой подвижной фазой (элюентом) служит жидкость. Неподвижной фазой может быть твердый сорбент, твердый носитель с нанесенной на его поверхность жидкостью или гель. Различают колоночную жидкостную хроматографию, в которой через колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси веществ в потоке элюента (под давлением или под действием силы тяжести), и тонкослойную жидкостную хроматографию, в которой элюент перемещается под действием капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлическую фольгу, вдоль пористой полимерной пленки, по поверхности цилиндрической кварцевой или керамической палочки, по полоске хроматографической бумаги. Разработан также метод тонкослойной жидкостной хроматографии под давлением (элюент прокачивают через слой сорбента, зажатого между пластинами). Жидкостная хроматография применяется как аналитическая и препаративная. Хроматография как метод разделения веществ предложена М. С. Цветом в 1903 на примере жидкостной хроматографии. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. HPLC, High performance liquid chromatography) – один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии, и в биотехнологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии. Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления и мелкозернистых сорбентов. Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин). В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используют колонки диаметром до 5 мм, плотно упакованные сорбентом с частицами малого размера (обычно 3-5 мкм, сейчас до 1,8 мкм); давление для прокачивания элюента до 3,107 Па (ее называют также хроматографией высокого давления). Варианты ВЭЖХ – микроколоночная хроматография на наполненных колонках малого диаметра и капиллярная хроматография на полых и наполненных сорбентом капиллярных колонках. К жидкостной хроматографии обычно относят также гидродинамическую хроматографию, где неподвижная фаза отсутствует. В этом случае используют тот факт, что скорость потока элюента максимальна в центре полого капилляра и минимальна у его стенок, а разделяемые компоненты распределяются между движущимися с разной скоростью слоями элюента в соответствии со своими размерами или под влиянием наложенного в поперечном направлении внешнего силового поля (центробежного, электрического, магнитного). Основные виды. По механизму удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой жидкостная хроматография делится на осадочную хроматографию, адсорбционную, распределительную, ионообменную хроматографию (в т. ч. ионную хроматографию), ион-парную, лигандообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию (ситовую) и аффинную хроматографию (биоспецифическую). Осадочная жидкостная хроматография основана на различной растворимости осадков, образующихся при взаимодействии компонентов анализируемой смеси с реагентом-осадителем. Преимущества метода в том, что получающиеся вдоль сорбента зоны имеют резкие границы, содержат осадки только одного вещества и часто разделены зонами чистого сорбента. Метод пока не нашел широкого распространения. Адсорбционная жидкостная хроматография в зависимости от относительной полярности сорбента и элюента подразделяется на нормально-фазную и обращенно-фазную. В первом случае адсорбция веществ происходит на полярном сорбенте (напр., силикагеле, содержащем гидроксильные (силанольные) группы) из неполярного элюента благодаря донорно-акцепторному взаимодействию или образованию водородных связей. Во втором – на поверхности гидрофобизированного сорбента из полярного элюента благодаря дисперсионному (гидрофобному) взаимодействию разделяемых молекул с поверхностью (образование водородной связи возможно в подвижной фазе с молекулами элюента, который, как правило, содержит воду). В распределительной жидкостной хроматографии разделение основано на распределении веществ между двумя жидкими фазами: неподвижной, нанесенной на поверхность носителя, и подвижной элюентом. В зависимости от полярности жидких фаз возможны нормально-фазный и обращeнно-фазный варианты. В первом случае на поверхность или в поры пористого носителя наносится полярная жидкость, не смешивающаяся с неполярным элюентом, во втором – используется неполярная неподвижная фаза и полярный элюент. В ионообменной жидкостной хроматографии разделение основано на различной способности разделяемых ионов к реакции ионного обмена с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего. В зависимости от знака заряда фиксированных ионов различают катиониты (закреплен анион) и аниониты (закреплен катион). Разделение ионов регулируют подбором оптимальных значений рН элюента и его ионной силы. Вариант ионообменной жидкостной хроматографии – ионная хроматография, в которой разделенные анионы (катионы) детектируют в виде кислот (соответствующих оснований) высокочувствительным кондуктометрическим детектором, а высокоэффективные колонки наполнены поверхностно-активным ионитом с небольшой емкостью. Ион-парную жидкостную хроматографию можно рассматривать как комбинацию адсорбционной и ионообменной; в качестве неподвижной фазы используют гидрофобизированный адсорбент, а подвижной – водно-органический элюент с добавлением поверхностно-активных ионогенных соединений (ион-парных реагентов), например, додецилсульфата Na или триметилцетиламмоний бромида. Разделение основано на удерживании ион-парного реагента на гидрофобной поверхности адсорбента с образованием ионита, который и проводит разделение ионогенных соединений. Возможно также образование ионных пар разделяемых ионов с ион-парным реагентом, которые затем удерживаются на гидрофобизированной поверхности адсорбента. Лигандообменная жидкостная хроматография основана на различной способности разделяемых соединений образовывать комплексы с катионами переходных металлов: Cu(II), Ni(II), Zn(II), Cd(II), Co(II) и др. и фиксированными группами (лигандами) неподвижной фазы. Часть координационной сферы ионов металла занята молекулами воды или другими слабыми лигандами, которые могут вытесняться молекулами разделяемых соединений. Наиболее эффективна для разделения оптических изомеров. Аффинная жидкостная хроматография основана на образовании прочной связи со специфическими группами неподвижной фазы (лигандами, аффинантами). Взаимодействие лигандов с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних. Так, при разделении ферментов лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты, токсинов – рецепторы, белков – антитела и т. д. Особенно эффективна в биотехнологии и биомедицине для выделения ферментов, белков, гормонов. В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) жидкостной хроматографии разделение основано на различиях в размерах молекул; молекулы малых размеров проникают в сравнительно тонкие поры сорбента и задерживаются в них, крупные молекулы либо не проникают в поры, либо проникают лишь в широкие поры и проходят колонку с незначительным удерживанием. Поверхность сорбента и состав элюента подбирают так, чтобы исключить или уменьшить энергию адсорбционного взаимодействия (однако иногда при разделении олигомеров удобнее использовать адсорбционный механизм). Применяют для разделения олигомеров и полимеров (в т. ч. биологических).
|
