Б. Пиридиннуклеотидные коферменты

Все дегидрогеназы нуждаются в коферменте для переноса восстановительных эквивалентов (см. с. 108). Наиболее широко распространены коферменты динуклеотидного типа (см. с. 86), в котором два нуклеозид-5'-монофосфата соединены фосфоангидридной связью. ЛДГ и многие другие дегидрогеназы нуждаются в никотинамидадениндинуклеотиде, сокращенно НАД⁺ (NAD⁺) (1). Обе нуклеотидных группы НАД⁺ построены из 5'-АМФ и нуклеотида, содержащего в качестве основания амид никотиновой кислоты (см. с. 354). Структурно (но не функционально) похожим коферментом является НАДФ⁺ (NADP⁺), в котором 2'-ОН-группы рибозы аденина дополнительно связаны с фосфатом. Несмотря на близкое структурное родство НАД⁺ и НАДФ⁺ осуществляют различные функции в обмене веществ (см. с. 114).

В окислительно-восстановительных реакциях пиридиннуклеотидного кофермента участвует только никотинамидное кольцо (2). Никотинамид является амидом пиридин-3-карбоновой (никотиновой) кислоты. В окисленной форме кольцо имеет ароматический характер и несет положительный заряд. По этой причине кофермент в окисленном состоянии обозначают как НАД⁺. При окислении лактата дегидрогеназа отщепляет от субстрата (AH₂) два атома водорода [т. е. два электрона и два протона (2, середина)]. Однако на НАД⁺ переносится только гидрид-ион (H^-, два электрона и один протон). Акцептором гидрид-иона является атом углерода в пара-положении к атому азота кольца НАД⁺. В этом месте образуется алифатическая СН₂-группа, перестраиваются двойные связи кольца и исчезает положительный заряд (2, внизу). При окислении или восстановлении никотинамидного кольца изменяются также спектральные характеристики кофермента. Поэтому за реакцией можно легко следить фотометрически (см. с. 106).

Второй протон высвобождается в среду и, следовательно, правильное наименование восстановленной формы кофермента NADH + H⁺, а не NADH₂.

 

Лактатдегидрогеназа: механизм каталитической реакции

 

Механизм действия лактатадегидрогеназы(ЛДГ) можно представить на основе общих закономерностей ферментативного катализа, которые изложены на с. 96.

 

А. Лактатдегидрогеназа: каталитический цикл

ЛДГ катализирует передачу восстановительного эквивалента от лактата на НАД⁺ (NАD⁺) или от НАДН (NADH) на пируват.

L-лактат + НАД⁺ ↔ пируват + НАДН + H⁺

Равновесие реакции сдвинуто в сторону образования лактата (см. с. 24). Однако при высоких концентрациях лактата и НАД⁺ возможно окисление лактата в пируват. ЛДГ катализирует реакцию в обоих направлениях, но подобно всем ферментам не влияет на положение химического равновесия.

Из-за обратимости реакции каталитический процесс можно представить в виде движения по кругу. Каталитический цикл ЛДГ представлен на схеме в виде шести моментальных «снимков». Приведенные на схеме промежуточные стадии катализа очень кратковременны и поэтому строго не доказаны. Однако их существование подтверждается множеством экспериментальных данных

В активном центре ЛДГ принимают участие многие аминокислотные остатки. Они способствуют присоединению субстратов и кофермента или непосредственно участвуют в одной из стадий катализа. Здесь показаны лишь три особенно важные боковые цепи аминокислот: положительно заряженная гуанидиновая группа аргинина-171 связывает карбоксильную группу субстрата с помощью электростатического взаимодействия, имидазольная группа гистидина-195 принимает участие в кислотно-основном катализе, боковая цепь аргинина-109 важна для стабилизации переходного состояния. В противоположность His-195, меняющему свой заряд во время катализа, оба упомянутых остатка аргинина протонированы постоянно. Кроме этих трех остатков важную роль играет пептидная петля 98-111, показанная схематически (окрашена в малиновый цвет) на рис. 103. Ее функция состоит в том, чтобы после связывания субстрата и кофермента закрыть активный центр и исключить доступ молекул воды во время переноса электронов.

Рассмотрим теперь отдельные стадии катализируемого ЛДГ восстановления пирувата: в свободном ферменте (1) His-195 протонирован, в связи с чем эта форма обозначена как E ∙ H⁺ . Кофермент НАДН связывается первым (2), а за ним - пируват (3) Важно, что в молекуле фермента карбонильная группа пирувата и никотинамидное кольцо кофермента в активированном состоянии расположены друг относительно друга оптимально и такая ориентация фиксирована (сближение и ориентирование субстратов). Затем закрывается петля 98-111 над активным центром. Сильно пониженная полярность в области активного центра облегчает образование переходного состояния (4; доступ воды закрыт). В переходном состоянии гидрид-ион H^- (см. с. 104) переносится с кофермента на карбонильный углерод (перенос группы). При этом временно образующийся энергетически невыгодный отрицательный заряд на кислороде стабилизируется электростатическим взаимодействием с Arg-109 (стабилизация переходного состояния). Одновременно осуществляется перенос протона с Нis-195 на атом кислорода (перенос группы), приводя к образованию связанных с ферментом лактата и НАД⁺ (5). После открытия петли лактат диссоциирует с фермента и временно незаряженная имидазольная группа Нis-195 снова присоединяет протон из окружающей воды (6). Наконец, освобождается также окисленный кофермент НАД⁺ и снова достигается исходное состояние (1). При окислении лактата в пируват протекают то же стадии, но в противоположном направлении

Входящий в уравнение реакции протон присоединяется не одновременно с NADH а после освобождения лактата, т. е. между стадиями (5) и (6) предшествующего цикла.