Метод тонкослойной хроматографииХроматография — физико-химический метод разделения веществ или частиц, основанный на различии в скорости их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. В более широком смысле хроматографией называют науку о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Эти два определения даны Научным советом по хроматографии и адсорбции РАН. Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) является одним из основных методов определения токсикантов. Методические приемы, разработанные в 70–80-е гг. прошлого столетия, значительно увеличили эффективность ТСХ: · существует возможность разделения (за один цикл) до 40 компонентов анализируемых смесей; · время разделения составляет 15–20 мин; · существует возможность анализировать нанограммовые количества (10–9 г) проб; · предельно определяемые количества отдельных компонентов достигают 10–15 г. Один из вариантов ТСХ получил название ВЭТСХ — высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Во многих случаях у оперативных и следственных подразделений возникает необходимость определения природы вещества и отнесения его к наркотическим средствам до возбуждения уголовного дела. Поэтому применяемые методы должны в короткие сроки надежно идентифицировать представленное на исследование вещество и квалифицировать совершенное преступление. Одним из таких методов является ТСХ. Методическая и приборная база этого метода позволяют автоматизировать и стандартизировать условия проведения исследований для получения воспроизводимых результатов. Использование селективных реактивов для определения, например, наркотических, психотропных и сильнодействующих веществ резко повышает надежность их идентификации. Хроматографические зоны исследуемых веществ легко извлекаются с пластин, что позволяет дополнять уже имеющуюся информацию об этих веществах результатами исследования другими методами, например спектральными. На практике получили широкое распространение инструментальные методы определения разделенных зон непосредственно на хроматографических пластинах. Получение спектров отражения исследуемого токсиканта в видимой, УФ-, ИК-областях света, наряду с данными поведения вещества в различных хроматографических системах, в ряде случаев имеет положительное судебно-химическое значение. Основы ТСХ и ее применение для исследований различных групп токсикантов обсуждены во многих монографиях и обзорах. ТСХ при проведении ХТА используют для решения двух задач: · подтверждения (или отрицания) присутствия конкретного вещества в исследуемом образце (направленный скрининг ); · скрининговых исследований образца неизвестной природы (ненаправленный скрининг). Для решения каждой из этих задач используют различные методические подходы. Методика проведения эксперимента. В ТСХ обычно используют закрепленные слои на металлической, стеклянной или пластиковой подложке. Для закрепления слоя применяют гипс, крахмал или другие связующие компоненты, а в качестве адсорбентов — силикагели различного зернения, обработанные или не обработанные реактивами для осуществления как прямого, так и обращенно-фазового вариантов хроматографии, а также целлюлозу, оксид алюминия, полиамиды и некоторые другие материалы. Часто к адсорбентам добавляют флуоресцентный индикатор. В криминалистической практике обычно используют пластины размером 5´5, 10´10 или 20´20 см. Хроматографирование веществ проводят в герметически закрытых камерах. При этом наиболее часто из всех возможных вариантов используется восходящее и горизонтальное элюирование хроматографической системы растворителей. В ряде случаев хорошие результаты дает многомерная и круговая хроматография. Перед началом разделения пластину размечают соответствующим образом: отмечают линии старта и фронта растворителя, зоны хроматографирования исследуемых веществ и стандартов-метчиков. Особо отмечают условия эксперимента и дату его проведения, а также другую необходимую информацию. Все отметки на пластине не должны нарушать равномерность слоя адсорбента. Анализируемые растворы осторожно, чтобы не повредить поверхность слоя адсорбента, наносят на пластину в несколько приемов, используя мерные капилляры или микрошприцы, обращая внимание на размеры получаемого пятна. Одновременно на пластину наносят эталонные растворы исследуемых веществ или растворы метчиков в соответствии с утвержденными методиками. Системы растворителей смешивают в требуемых соотношениях непосредственно перед использованием при помощи интенсивного перемешивания. Иногда при смешивании растворителей возможно образование мутного раствора. В таких случаях полученную смесь заливают в хроматографическую камеру, стенки и дно которой проложены фильтровальной бумагой. Если в конкретной методике нет специального разъяснения, то камеры герметически закрывают крышкой и оставляют на 0,5–1 ч для насыщения парами растворителя (установления равновесия). Для каждой новой пластины готовят новую порцию системы. Допускается временное хранение готовой системы в посуде с притертой пробкой. Количество растворителя для проведения эксперимента рассчитывают таким образом, чтобы при восходящем варианте проведения хроматографии уровень его соответствовал погружению пластины не более чем на 5 мм. Расход системы на стандартную камеру для пластин размером 10´10 см с плоским дном составляет 4–4,2 мл. Хорошей практикой считается использование отдельной хроматографической камеры для каждой конкретной разделительной системы. При необходимости быстрой смены используемой системы растворителей камеру просушивают, промывают 10 мл этанола, сушат и затем промывают растворителем, использование которого планируется. После помещения пластинки в хроматографическую камеру растворитель движется по пластине под действием капиллярных сил, пока не достигнет линии финиша, после чего пластинку вынимают и сушат. В разделе ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ, в графах c Rf1 по Rf10, приведены значения hRf веществ, полученные с использованием рекомендованных хроматографических систем Международной Ассоциацией Судебных Токсикологов. Значения приведены по изданию «Thin-Layer Chromatographic Rf values of toxicologically relevant substances on standardized systems; Second, revised and enlarged edition, Report XVII of the DFG commission for Clinical-Toxicological Analysis, Special issue of the TIAFT bulletin, 1992». В соответствии с данным руководством экспериментально полученное значение hRf соответствует отношению длины пробега хроматографической зоны исследуемого вещества к длине пробега фронта растворителя в процентах. Для корректировки влияния на эти значения таких факторов, как количество нанесенного вещества, общая длина пробега растворителя, степень насыщенности хроматографической камеры парами растворителя, температура окружающей среды и др. предполагается для каждой системы использование до четырех веществ-сравнения, значения hRf которых в данной системе равномерно распределяются от 0 до 100 и приведены в таблице ниже. Для получения откорректированных значений hRf исследуемого вещества в конкретной хроматографической системе можно использовать два метода: графический и численный. В первом случае строится график на оси абсцисс, которого наносятся экспериментально полученные значения для исследуемого вещества и веществ сравнения. При чем точка старта имеет значение (0,0), а фронт растворителя (100,100). На оси ординат – табличные значения hRf веществ сравнения.
Во втором случае используется следующая формула расчета:
Таблица 1. Хроматографические системы, вещества-сравнения и их значения Rf, а также ошибки воспроизведения значений Rf в указанных системах.
Приведенные в данной таблице хроматографические системы растворителей готовятся по объему. Все они применяются с использованием насыщения хроматографической камеры, за исключением систем 5 и 6. Система 4 может применяться как для кислых и нейтральных веществ (система 4а), так и для веществ основного и нейтрального характера (система 4б). Для исследования используются метанольные или спиртовые растворы веществ-сравнения в концентрации 2 мг/мл каждого. Приведенное в таблице «поисковое» окно представляет собой утроенную межлабораторную ошибку определения значений hRf в конкретной хроматографической системе.
|
где
- значения hRf для веществ-сравнения A и B, а также неизвестного вещества Х. Индекс с указывает на то, что используется откорректированное значение параметра.
