Методическая разработка практического занятия для учащихся отделения «Медико-диагностическое дело» по дисциплине

инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробами»

Цель занятия: отработать методику микробиологической диагностики инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробами

Самостоятельная работа:

1. Изучение схемы микробиологической диагностики инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробами.

2. Изучение морфологии неспорообразующих анаэробов – микроскопия музейных препаратов.

3. Приготовление питательных сред для их культивирования

4. Посев исследуемого материала на питательные среды для выделения неспорообразующих анаэробов

5. Закрепление навыков работы с микроанаэростатом, газогенерирующими пакетами.

Методические указания к практической работе:

В качестве исследуемого материла при подозрении на анаэробную инфекцию используют: 1) инфицированные повреждения из желудочно-кишечного тракта или женских половых путей, 2) материал из брюшной полости при перитонитах и абсцессах, 3) кровь от септических больных, 4) отделяемое при хронических воспалительных заболеваниях дыхательного тракта (синуситах, отитах, мастоидитах), 5) материал из нижних отделов дыхательного тракта при аспирационной пневмонии, 6) спинномозговая жидкость при менингите, 7) содержимое абсцесса мозга, 8) локальный материал при стоматологических заболеваниях, 9) содержимое поверхностных абсцессов, 10) содержимое поверхностных ран, 11) содержимое инфицированных ран, 12) биоптаты

Лабораторное исследование основано на индикации и последующей видовой идентификации анаэробных микроорганизмов, содержащихся в исследуемом материале, с помощью традиционных и экспресс методов, а также на определении чувствительности выделенных микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам.

Имеется много быстрых прямых тестов, которые убедительно указывают на присутствие анаэробов в большом количестве в исследуемом материале. Некоторые из них весьма просты и дешёвы и поэтому имеют преимущества перед многими дорогостоящими лабораторными исследованиями.

1. Запах. Зловонные материалы всегда содержат анаэробы, только единичные из них не имеют запаха.

2. Газожидкостная хроматография (ГЖХ). Относится к числу экспресс методов диагностики. ГЖХ позволяет определить в гное короткоцепочечные жирные кислоты (уксусную, пропионовую, изовалериановую, изокапроновую, капроновую), которые обуславливают запах. С помощью ГЖХ по спектру летучих жирных кислот можно осуществить видовую идентификацию присутствующих в нём микроорганизмов.

3. Флуоресценция. Исследование материалов (гноя, тканей) в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм позволяет выявить интенсивную красную флуоресценцию, которая объясняется присутствием чёрно пигментированных бактерий, принадлежащих к группам Bacteroides и Porphyromonas, и которая указывает на наличие анаэробов.

4. Бактериоскопия. При исследовании многих препаратов, окрашенных по методу Грама, в мазке выявляется присутствие клеток воспалительного очага, микроорганизмов, особенно полиморфных грамотрицательных палочек, малых грамположительных кокков или грамположительных бацилл.

5. Иммунофлуоресценция. Прямая и непрямая иммунофлуоресценция являются экспресс методами и позволяют выявить анаэробные микроорганизмы в исследуемом материале.

6. Иммуноферментный метод. Иммуноферментный анализ позволяет определить наличие структурных антигенов или экзотоксинов анаэробных микроорганизмов.

7. Молекулярно - биологические методы. Наибольшее распространение, чувствительность и специфичность в последние годы показала цепная полимеразная реакция (ЦПР). Она применяется как для выявления бактерий непосредственно в материале, так и для идентификации.

Материал, забранный из соответствующих источников и в подходящие для этих целей контейнеры или транспортную среду, должен быть доставлен незамедлительно в лабораторию. Однако имеются сведения, что клинически значимые анаэробы в больших объёмах гноя или в анаэробной транспортной среде выживают в течение 24 часов.

Исследование анаэробных микроорганизмов осуществляется в несколько этапов. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и делают посев на І этапе на питательные среды.

Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребностям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адекватно редуцированными. Первичный посев материала осуществляется на чашки с кровяным агаром, на кровяной агар Шэдлера (или среда №1 – неселективный анаэробный гемагар), элективные среды:

Желчно-эскулиновый агар для бактероидов ( BBE agar) - длявыделения бактерий группы Bacteroides fragilis

Канамицин-ванкомицин кровяной агар (KVLB) - для большинства неспорообразующих грамотрицательных бактерий

Фенил-этиловый агар (PEA) - для грамположительных и грамотрицательных анаэробов

Кристалл-виолет-эритромициновый агар (CVEB) - для Fusobacterium nucleatum

Бактероид гингивалис агар (BGA) - для выделения Porphyromonas gingivalis

Всё чаще выделение облигатных анаэробов из клинического материала осуществляется на средах, которые включают селективные агенты в определённой концентрации, позволяющие выделить определённые группы анаэробов. Так, для выделения облигатных анаэробов из клинического материала к анаэробному кровяному агару добавляют: неомицин (70мг/л), налидиксовую кислоту (10мг/л),

Bacteroides spp., Fusobacterium spp. – налидиксовую кислоту (10 мг/л)+ванкомицин (2,5 мг/л), Bacteroides urealytica - налидиксовую кислоту (10 мг/л), тейкопланин (20 мг/л), Fusobacterium – рифампицин (50 мг/л), неомицин (100 мг/л), ванкомицин (5 мг/л): НКТ-гемагар, НКР-гемагар, НКРБ-гемагар.

Кровяной агар инкубируют при 37^оС 18-20 ч в атмосфере 5-10% CO₂ . Все остальные среды инкубируют при 37^о от 48 ч до 7 дней в микроанаэростате (коммерческие газогенерирующие пакеты, автоматически герметизированная со стеклянной передней стенкой камера – анаэробная станция с резиновыми перчатками и автоматической подачей безкислородной смеси газов – N₂, H₂, CO₂, куда помещается весь материал через специальный люк). Кроме того, производят посев на жидкую тиогликолевую среду и инкубируют при 37^о от 48 ч до 2-х недель. Изучение характера роста осуществляют путём описания колоний, их пигментации, флуоресценции, гемолиза.

Фузобактерии на КА через 48 ч дают выпуклые желтоватые колонии 1-2мм с зоной гемолиза. В МБС колонии голубоватые, беловатые, имеют волнистость (барашки), в УФО светятся изумрудным светом только F.nucleatum. Очень характерным является «сырный»(гнилостный) запах при их культивировании из-за выделения большого количества индола.

Бактероиды – колонии разные, плосковатые, вросшие в агар или нет, серовато- беловатые. На плотных средах через 2-3-7 суток образуются мелкие 0,5-2 мм серовато-белые слегка вогнутые колонии (яичница, вросшая в агар) с зеленоватым ободком на КА – у B.ureolyticum. B.fragilis даёт крупные маслянистые серые колонии, на желчно-эскулиновом агаре образует тёмный пигмент и не даёт свечения под действием УФО в отличие от других представителей рода, дающих красное свечение. Prevotella даёт мелкие колонии и образует пигмент тёмно-коричневого, чёрного цвета, под действием УФО колонии привотелл дают красное (рубиновое) свечение.

Porphyromones дают тёмно-коричневый или чёрный пигмент и красную флуоресценцию в УФО. Колонии вейлонелл мелкие 1-3 мм гладкие непрозрачные, серовато-белые маслянистые, чечевице-, ромбо- или сердцевидные без зоны гемолиза (росинки). Peptococcus niger дает чёрные колонии, но не даёт свечения. Затем из колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют для изучения морфологии.

В мазках, окрашенных по Граму, фузобактерии представляют собой зернистые веретенообразные грамотрицательные палочки с заостренными концами, располагаются беспорядочно, в виде нитей (напоминают сено, барашки).

Бактероиды – мелкие грамотрицательные короткие с зернистостью палочки с закругленными концами, прямые или слегка изогнутые, но бывают бациллярной и нитевидной формы, в мазках располагаются беспорядочно, попарно и короткими неправильными цепочками. Prevotella представляет собой грамотрицательные коккобациллы.

Mobiluncus – изогнутые грамотрицательные палочки.

Вейлонеллы – грамотрицаельные диплококки бобовидной формы, в мазке располагаются одиночно, по 2, в виде коротких цепочек и скоплений (как горох).

Пептококки – грамположительные кокки, располагаются по 1, парами, тетрадами, группами.

Пептострептококки – очень маленькие круглые или овальные кокки, располагающиеся цепочкой.

В дальнейшем микроорганизмы каждого типа колоний пересевают и культивируют в тиогликолевом бульоне с добавлением гемина и витамина К.

На III этапе исследования проводят изучение свойств выделенной культуры с целью последующей идентификации. Конечная идентификация основывается на определении биохимических свойств, физиологических и генетических характеристик, факторов патогенности. Хотя полнота идентификации может варьировать, некоторые простые тесты с высокой вероятностью позволяют идентифицировать чистые культуры анаэробных бактерий – окраска по Граму, подвижность, определение чувствительности к некоторым антибиотикам методом бумажных дисков и биохимические свойства.

 

 

 

Методическая разработка практического занятия для учащихся отделения «Медико-диагностическое дело» по дисциплине