ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 2

Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1802

«ЗАГАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ АМІНОКИСЛОТ»

Мета заняття: вивчити загальні властивості амінокислот.

План заняття

1. Визначити наявність ά-аміногруп в амінокислотах за допомогою азотистокислого натрію та оцтової кислоти.

2. Визначити наявність ά-аміногруп в амінокислотах (по нінгідрину).

3. Визначити буферні властивості амінокислот.

4. Виявити пептидний зв’язок між амінокислотами.

1. Визначення наявності ά-аміногрупи в амінокислотах за допомогою азотистокислого натрію та оцтової кислоти

Об'єкт дослідження: Будь-яка амінокислота (5 %-й розчин) або гідролізат білка (10 %-й розчин).

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Піпетки на 1…2 мл.

Реактиви: 1. Азотистокислий натрій, 3 %-й розчин;

2. Оцтова кислота концентрована (льодяна) або H₂SO₄ 1,5 %-й розчин;

Техніка виконання роботи

В одну пробірку наливають 1 мл розчину, що досліджується (амінокислота або білок). У другу – стільки ж води (контрольна проба). В обидві пробірки доливають рівний об'єм азотистокислого натрію та по 1 мл оцтової або сірчаної кислоти. Суміш струшують. Порівнюють інтенсивність утворення бульбашок із газоподібного азоту в обох пробірках – (поодинокі бульбашки газу в контрольній пробі – це окиси азоту, що утворюються в результаті руйнування азотистої кислоти).

2. Дослідження наявності α- аміногрупи в амінокислотах (нінгідринова реакція)

Реакцією α-аміногрупи, що характерна та частіше всього застосовується, є нінгідринова реакція (для точного визначення зовсім незначних концентрацій амінокислот). Усі амінокислоти і пептиди, що містять ᾳ-аміногрупу, дають з нінгідрином синє забарвлення.

Об'єкт дослідження: Будь-яка амінокислота (5 %-й розчин) або гідролізат білка (10 %-й розчин).

Обладнання і посуд: 1. Нагрівальний прилад;

2. Штатив з пробірками;

3. Крапельниці.

Реактиви: Нінгідрин, 0,2 %-й спиртовий розчин.

Техніка виконання роботи

У пробірку наливають 1 мл розчину, що досліджується, додають 1 мл нінгідрину. Суміш нагрівають до кипіння і дають остигнути. Спостерігають появу забарвлення.

3. Визначення буферних властивостей амінокислот

Буферні властивості амінокислот визначають шляхом співставлення кількості лугу або кислоти, які потрібно додати до розчину цих речовин і до води, щоб змінити реакцію середовища на лужну або, відповідно, на кислу. Обидві рідини мають близькі вихідні значення рН. З метою визначити, як змінюється цей показник у лужну сторону використовують за індикатор фенолфталеїн, який набуває червоного забарвлення при рН 8,3…10. Зміна реакції середовища на кислу визначається за допомогою метилоранжу, для якого зона переходу жовтого забарвлення в нейтральному і слабкокислому середовищі на оранжеве відбувається при рН 3,1…4,4.

Об'єкт дослідження: Розчин будь-якої амінокислоти або гідролізату білків.

Обладнання і посуд: 1. Штатив з пробірками;

2. Піпетки на 2 мл з поділками.

Реактиви: 1. Гідрооксид натрію, 0,05 н розчин;

2. Соляна кислота 0,05 н розчин;

3. Фенолфталеїн, 0,1 %-й розчин у 50 %-му спиртово-му розчині;

4. Метилоранж, 0,1 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

У дві пробірки наливають по 2 мл розчину амінокислоти або гідролізату білків, у дві інші – по 2 мл води. В одну пробірку з джерелом амінокислот і в одну з водою доливають по 1…2 краплі фенолфталеїну, після чого з допомогою NаОН доводять реакцію до слаболужної. Спостерігають, який об'єм лугу витрачений у кожній пробі для зміни рН на лужну.

До решти пробірок наливають по 1-й краплі метилоранжу і титрують НСl до появи оранжевого забарвлення. Відмічають, скільки витрачено НСl для зміни рН.

4. Виявлення пептидного зв'язку між амінокислотами

У молекулах білків усі амінокислоти зв'язані пептидним зв'язком (первинна структура протеїнів). Пептидний зв'язок виявляється за допомогою біуретової реакції Піотровського по утворенню фіолетово-червоної сполуки груп (СООН) з міддю в сильно-лужному середовищі.

Об'єкт дослідження: 1. Яєчний білок, 1%-й розчин;

2. Молоко;

3. Желатин, 1 %-й розчин;

4. Глікоколь, 1 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив з пробірками;

2. Піпетка на 1 мл;

3. Крапельниці.

Реактиви: 1. Гідроксид натрію, 10 %-й розчин;

2. Мідь сірчанокисла, 5 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

В одну пробірку наливають 1 мл розчину яєчного білка, другу – стільки ж молока, у третю – желатину, у четверту – глікоколю. До кожної пробірки доливають рівний об'єм гідроксиду натрію, перемішують і додають по 1мл розчину сірчанокислої міді. Слід уникати надміру СuSO₄, синій колір якого буде маскувати фіолетово-червоне забарвлення, яке свідчить про наявність пептидних зв'язків. Визначають зміну забарвлення в кожній пробірці.

5. Кількісне визначення ά-аміногруп формольним титруванням

Кількісне визначення α-аміногруп можливо виконати одночасно з визначенням карбоксильних груп титруванням, тому що кількість карбоксильних груп еквівалентна кількості пов'язаних з формальдегідом α-аміногруп.

Об'єкт дослідження: розчин будь-якої амінокислоти або гідролізат білка.

Обладнання і посуд: 1. Штатив з пробірками;

2. Піпетки на 1; 5; 10 мл;

3. Колби на 100 мл.

Реактиви: 1. Гідрооксид натрію, 0,05 н розчин;

2. Фенолфталеїн, 0,1 % -й розчин у 50 %-му етанолі;

3. Формольна суміш;

4. Дистильована вода.

Техніка виконання роботи

Готують дві колби об'ємом 100 мл. До однієї вносять 40 мл розчину, який досліджується, до другої – 40 мл дистильованої води. Додають по 10 крапель розчину фенолфталеїну та розчин 0,05 н NаОН до появи ледве помітного рожевого кольору. Потім до обох колб додають по 10 мл формольної суміші та титрують з бюретки розчином гідроксида натрія до появи ледь помітного рожевого забарвлення. Колір контролю та розчину, який досліджується, повинен бути однаковим.

Масову концентрацію амінокислот (мг/мл) розраховують за формулою:

C = (A-B)fQ/V,

де А і В – об'єми розчину гідроксида натрія, що пішов на титрування проби та контролю відповідно (мл);

f – коефіцієнт поправки на титр 0,05 моль/л розчину гідроксида натрія;

Q – маса амінокислот, що еквівалентна 1 мл 0,05 моль/л розчину гідроксида натрія (0,7 мг);

V – об'єм розчину амінокислоти, що був взятий для аналізу.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 3

«КОЛЬОРОВІ РЕАКЦІЇ НА АМІНОКИСЛОТИ»

Мета заняття: вивчити кольорові реакції на амінокислоти.

План заняття

1. Виявити наявність тирозину у складі різних білків за допоїмо-гою ксантопротеїнової реакції.

2. Виявити наявність триптофану у складі білків за допомогою реакції Адамкевича.

3. Визначити наявність метіоніну у складі білків.

4. Виявити наявність гістидину за допомогою реакції Ерліха.

Присутність білка можна виявити низкою кольорових реакцій. Ці реакціїзумовлені наявністю в молекулі білка тієї чи іншої амінокислоти або хімічного групування, яке вони утворюють. Тому кольорові реакції на білки використовують для доказу білкової природи речовини, вивчення амінокислотного складу різних природних білків і кількісного визначення в білках тієї чи іншої амінокислоти.

1. Виявлення тирозину у складі різних білків (ксантопротеїнова реакція)

Білки під час нагрівання з міцною азотною кислотою дають жовте забарвлення. Реакція зумовлена наявністю в білку ароматичних амінокислот, які зазнають нітрування азотною кислотою. Ці нітропохідні амінокислоти забарвлені у жовтий, а у лужному середовищі – в оранжевий колір (солі хіноїдної структури).

Об'єкт дослідження:1. Яєчний білок;

2. Розчин желатину.

Обладнання і посуд:1. Штатив із пробірками;

2.Піпетки;

3. Крапельниці;

4. Нагрівальний прилад.

Реактиви: 1. НNО₃ концентрована;

2. NаОН, 30 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

В одну пробірку вносять 1 мл розчину яєчного білка, у другу – 1мл желатину. Добавляють по 1 мл концентрованої НNОз і обережно (!) нагрівають. У разі появи жовтого забарвлення суміш охолоджують і додають розчин 30 %-й NаОН по краплинах до появи оранжевого забарвлення.

2. Виявлення триптофану в складі білків (реакція Адамкевича)

У разі додавання до нерозбавленого білка незначної кількості гліоксилової кислоти в присутності концентрованої Н₂SO₄ з’являється червоно-фіолетове забарвлення, зумовлене здібністю триптофану в кислому середовищі взаємодіяти з альдегідами, даючи забарвлені продукти конденсації червоно-фіолетового кольору. Як джерело гліоксилової кислоти можна використати льодяну оцтову, в якій гліоксилова кислота завжди присутня в невеликій кількості.

Об'єкт дослідження: 1.Яєчний білок нерозбавлений або сироватка крові;

2. Желатин, 1 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Крапельниці;

3. Піпетки;

4. Нагрівальний прилад.

Реактиви: 1. Концентрована оцтова кислота;

2. Н₂SO₄ концентрована.

Техніка виконання роботи

У дві пробірки вносять по декілька краплин нерозбавленого яєчного білка (або сироватки крові) і розчину желатину. Добавляють до кожної по 1 мл концентрованої оцтової кислоти (діє, як водоотбираюча речовина) і нагрівають до розчинення осаду, що утворився. Після охолодження по стінці пробірки нашаровують 1 мл концентрованої Н₂SO₄. На межі двох рідин спостерігають появу червоно-фіолетового кільця при наявності триптофану.

3. Виявлення наявності метіонину у складі білків

Метіонин є важливим джерелом лабільних метільних груп. Вони потрібні для синтезу ацетілхоліну, адреналіну, креатину та інших біологічно активних речовин. Метіонин відіграє важливу роль в обміні ліпідів, тобто стимулює їхнє окислення і, як наслідок, – зменшення кількості ліпідів у тканинах. Тому харчові джерела метіонину необхідні при захворюваннях печінки, пошкодженому жировому обміні, контакті з пошкоджуючими факторами.

При нагріванні метіонину з концентрованими лугами він руйнується з утворенням Na₂S. При додаванні до нього оцтовокислого свинцю утворюється РbS чорного кольору.

Об'єкт дослідження: 1. Яєчний білок, 10 %-й розчин;

2. Желатин, 1 %-й розчин.

Обладнання і посуд:1. Штатив з пробірками;

2. Нагрівальний прилад.

Реактиви: 1. Їдкий натрій, 30 %-й розчин;

2. Оцтовокислий свинець, 5 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

У першу пробірку наливають 1 мл яєчного білка, у другу – 1 мл розчину желатину. У кожну пробірку додають по 5…10 крапель 30 %-го NаОН і по 0,5 мл 5 %-го розчину (СНзСОО)₂РЬ. Обидві проби нагрівають і спостерігають утворювання чорного осаду РЬS при наявності в складі білку амінокислот, що містять сірку.

4. Реакція Ерліха на гістидин

Під час змішування розчину № 1 (сульфанілова кислота в НС1) з розчином №2 (NаNО₂, водний розчин) і аміаком утворюється діазобензолсульфонова кислота, яка з гістидином дає вишнево-червоне забарвлення.

Об'єкт дослідження: 1. Яєчний білок, 10 %-й розчин;

2. Желатин, 1 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив з пробірками.

Реактиви: 1. Розчин №1 ( сульфанілова кислота в НСІ);

2. Розчин №2 (NаNО₂,водний розчин);

3. NаОН, 30 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

У першу пробірку наливають 1 мл яєчного білка, у другу – 1 мл розчину желатину. В обидві пробірки додають по 1 мл реактиву № 1, по 2...3 краплі реактиву №2 і NаОН – 30 %-й розчин до лужної реакції. Спостерігають зміну забарвлення.

Контрольні запитання

1. Яка роль білків в організації і функціях живої матерії?

2. Чим відрізняється елементарний склад білків від інших органічних речовин, що містяться в клітинах організму?

3. Які є структурні одиниці білків, що зумовлюють їх різноманітність?

4. Які функціональні групи характерні для всіх амінокислот?

5. Чим зумовлено буферні властивості амінокислот?

6. Який тип зв’язку між амінокислотами є характерним для білків?

7.До водного розчину амінокислоти додано універсальний індикатор. Визначено кислу реакцію. Яким амінокислотам властиві кислі реакції?

8. За допомогою відповідних реактивів в розчині білка визначено сірку. Які амінокислоти її містять?

9. Що таке незамінні амінокислоти і в яких продуктах вони містяться?

10. В чому полягає біологічна роль гліцину?

11. В чому полягає біологічна роль аргініну, гліцину і метіоніну?

12. В чому полягає біологічна роль тирозину і триптофану?

1.2.2. Білки: будова, Класифікація, властивості,