Тема 1.3. Ферменти; будова, властивості, класифікація. Біологічне окиснення

Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 9860

Всі біологічні каталізатори є речовинами білкової природи і носять назву ферментів або ензимів.

Ферменти не являються компонентами реакцій, а лише прискорюють досягнення рівноваги збільшуючи швидкість як прямого, так і зворотного перетворення. Прискорення реакції відбувається за рахунок зниження енергії активації того енергетичного бар'єру, який відокремлює один стан системи (початкову хімічну сполуку) від іншого (продукт реакції).

Ферменти прискорюють самі різні реакції в організмі.

Властивості ферментів.

1. Вплив на швидкість хімічної реакції: ферменти збільшують швидкість хімічної реакції, але самі при цьому не витрачаються.

2. Специфічність дії ферментів. У клітинах організму протікає 2-3 тис. реакцій, кожна з яких каталізується певним ферментом. Специфічність дії ферменту – це здатність прискорювати протікання однієї певної реакції, не впливаючи на швидкість інших, навіть дуже схожих. Специфічність ферментів обумовлена їх унікальною амінокислотною послідовністю, від якої залежить конформація активного центру, що взаємодіє з компонентами реакції. Речовина, хімічне перетворення якої каталізується ферментом носить назву субстрат.

3. Активність ферментів – здатність різною мірою прискорювати швидкість реакції.

Активність залежить в першу чергу від температури. Найбільшу активність той або інший фермент проявляє при оптимальній температурі. Для ферменту живого організму це значення знаходиться в межах (37,0…39,0°С), залежно від виду тварини. При пониженні температури сповільнюється броунівський рух, зменшується швидкість дифузії і, отже, сповільнюється процес утворення комплексу між ферментом і компонентами реакції (субстратами). В разі підвищення температури вище за 40,0…50,0°С молекула ферменту, яка являється білком, піддається процесу денатурації. При цьому швидкість хімічної реакції помітно падає.

Активність ферментів залежить також від рН-середовища. Для більшості з них існує певне оптимальне значення рН, при якому їх активність максимальна. Оскільки в клітині містяться сотні ферментів і для кожного з них існують свої межі оптимуму рН-середовища, тому зміна рН це один з важливих чинників регуляції ферментативної активності.

Механізм дії ферментів. Реакція каталізу складається з трьох послідовних етапів.

1. Утворення фермент-субстратного комплексу при взаємодії через активний центр.

2. Зв’язування субстрату відбувається в декількох точках активного центру, що приводить до зміни структури субстрату, його деформації за рахунок зміни енергії зв'язків в молекулі. Це друга стадія і називається вона активацією субстрату. При цьому відбувається певна хімічна модифікація субстрату і перетворення його в новий продукт або продукти.

3. В результаті такого перетворення нова речовина (продукт) втрачає здатність утримуватися в активному центрі ферменту і фермент-субстратний, вірніше вже фермент-продуктний комплекс дисоціює (розпадається).

Ферментативні регулятори – це речовини, що змінюють швидкість ферментативного каталізу і регулюють за рахунок цього метаболізм. Серед них розрізняють інгібітори–уповільнюючи швидкість реакції і активатори–прискорюючи ферментативну реакцію. Крім інгібіторів відомі ще активатори ферментативного каталізу, вони захищають молекулу ферменту від інактиваційних дій; утворюють із субстратом комплекс, який активніше зв'язується з активним центром ферменту, а також взаємодіючи із ферментом, що має четвертинну структуру, роз'єднують його субодиниці і тим самим відкривають доступ субстрату до активного центру.

Класифікація ферментів.

Ферменти поділяють на такі класи:

1. Оксидоредуктази. Каталізують окислювально-відновні реакції. Діляться на 17 підкласів. Всі ферменти містять небілкову частину у вигляді гема або похідних вітамінів В₂, В₅.

2. Трансферази – каталізують перенесення різних радикалів від молекули донора до молекули акцептора.

3. Гідролази – каталізують реакції гідролізу, тобто розщеплювання речовин з приєднанням по місцю розриву зв'язку води. До цього класу відносяться переважно травні ферменти.

4. Ліази–каталізують реакції розщеплювання молекул без приєднання води. Ці ферменти мають небілкову частину у вигляді тіамінпірофосфату (В₁) і пірідоксальфосфату (В₆).

5. Ізомерази–каталізують реакції ізомеризації.

6. Лігази (синтетази)–каталізують реакції синтезу складніших речовин із простих. Такі реакції йдуть з витратою енергії АТФ. До назви таких ферментів додають «синтетаза».

Біологічне окиснення. У процесі життєдіяльності організми поглинають з навколишнього середовища енергію в адекватній формі, а потім повертають її еквівалентну кількість, але вже в іншому виді. Основним носієм енергії є електрон (е^-). Одержавши визначену кількість енергії, він збуджується: переходить на більш високий енергетичний рівень. Роблячи зворотний шлях на нижню орбіту, електрон вивільняє таку ж кількість енергії

Для всіх організмів, що живуть на Землі, основним джерелом енергії служить сонячне випромінювання. Існує дві групи організмів, що розрізняються за способом харчування – аутотрофи і гетеротрофи. Автотрофи – (зелені рослини) здатні безпосередньо уловлюва-ти сонячну енергію і використовувати її для створення органічних сполук. Гетеротрофи – це організми, що асимілюють готові органічні речовини, які мають визначений запас потенційної енергії. У процесі їхньої життєдіяльності енергія вивільняється. У живих організмах енергія, що вивільняється при окислюванні, запасається в основному у виді хімічної енергії, що після використання переходить у теплоту. При окислюванні в неживій природі відбувається пряме приєднання кисню. У живій природі втрата гідрогену.

Встановлено, що універсальним резервом хімічної енергії, що утворюється в процесі окислювання органічних речовин у клітинах, є аденозинтрифосфат (АТФ). Ця сполука складається з аденіну, рибози і трьох залишків фосфорної кислоти. Таким чином, вивільнення енергії при окислюванні органічних речовин, на відміну від горіння, відбувається поступово. При цьому не виникають ті значні перепади температури, що характерні для горіння. Незалежно від окремих етапів окисного розщеплення органічних речовин у кінцевому рахунку утворюються ті ж продукти розпаду (СО₂ і Н₂О) і виділяється стільки ж енергії. Таким чином, джерелом енергії в організмі стає реакція між гідрогеном і оксигеном, у результаті чого утворюється вода. Сучасна теорія біологічного окиснювання об'єднала теорії Баха - Варбурга і Паладіна - Віланда на новому рівні розвитку досліджень цієї наукової проблеми. Отже, біологічне окислювання - це процес відщіплення атомів водню або електронів від субстрату і передача їх через ряд проміжних етапів на молекулярний кисень. У цьому процесі беруть участь ферменти: пирідинозалежні дегідрогенази (їх коферментну функцію виконує нікотинамідаденіндинуклеотид – НАД або нікотин-амідаденіндинуклеотидфосфат – НАДФ), флавінозалежні дегідроге-нази – флавінові ферменти (до складу їхньої простетичної групи входить флавінаденіндинуклеотид – ФАД або флавінаденінфосфат – ФАДФ); цитохроми (містять у якості простетичної групи залізопорфіринову кільцеву систему), а також убіхінон (коензим Q) і білки, що містять негемінове залізо.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 5

«ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ»

Мета заняття: вивчити властивості ферментів.

План заняття

1. Вивчити вплив різних температур на активність амілази.

2. Визначити чутливість ферментів до рН середовища.

3. Вивчити вплив активаторів та інгібіторів на активність ферментів.

4. Визначити специфічність дії ферментів.

1. Вивчення впливу різних температур на активність амілази

Фермент амілаза каталізує гідроліз крохмалю до декстринів і мальтози. Такий процес відбувається, наприклад, у ротовій порожнині при вживанні з їжею продуктів, що містять крохмаль: картоплі, хліба, макаронних виробів. Джерелом амілази є слина. Цей фермент знахо-диться і в інших відділах травного тракту, а також у печінці та інших тканинах. Різні типи амілаз використовуються в харчовій промис-ловості, наприклад, у пивоварній, де їх джерелом є рослини (ячмінь).

Дію амілази розпізнають по зникненню синього забарвлення, яке утворюється при додаванні йоду.

Об’єкт дослідження: Розчин панкреатину (джерело амілази).

Обладнання і посуд: 1. Термостат, нагрітий до 37^оС;

2. Холодильник;

3. Піпетки на 1...2 мл;

4. Крапельниці;

5. Нагрівальний прилад.

Реактиви: 1. Крохмаль картопляний, 1 %-й розчин;

2. Розчин йоду, 0,1 н, розбавлений безпосередньо перед визначенням до 0,004 н.

Техніка виконання роботи

У 3 пробірки наливають по 1 мл джерела амілази. Першу пробірку кип’ятять протягом не менш, ніж 3 хв., дають охолонути. Потім до всіх 3 пробірок приливають по 1 мл крохмалю. Другу пробірку кладуть у холодильник для охолодження до 10^оС. Третю ставлять у термостат, нагрітий до 37^о С. Через 10…15 хв. до усіх трьох пробірок приливають по 1...2 краплі розчину йоду. Якщо крохмаль не перетравився амілазою, то утворюється синє забарвлення. При наявності продуктів гідролізу колір з йодом стає фіолетовим, червоним або жовтим в залежності від глибини розщеплення та розміру утворених молекул декстринів. Амілодекстрини забарвлюються йодом у фіолетовий колір, ерітродекстрини – у червоний, ахродекстрини – утворюють жовте забарвлення, як і мальтоза. По кольору визначають глибину розщеплення крохмалю.

2. Вивчення чутливості ферментів до рН середовища

Об’єкт дослідження: Розчин панкреатину (джерело амілази).

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками, закритими пробками;

2. Піпетки на 1...2 мл;

Реактиви: 1. Буферний розчин, рН якого дорівнює 5,0 (10,30 мл О,2 М Na₂HPO₄ 2H₂O змішується з 9,70 0,1 М розчину лимонної кислоти);

2. Буферний розчин з рН 6,8 (15,45 мл 0,2 М Na₂HPO₄ змішується з 4,55 мл 0,1 М розчину лимонної кислоти);

3. Крохмаль, 1 %-й розчин;

4. Розчин йоду в йодистому калії 0,004 н., приготовлений шляхом розбавлення з 0,1 н. безпосередньо перед дослідженням. У такій концентрації, йод забарвлює крохмаль у синій колір і не припиняє дії амілази.

Техніка виконання роботи

У 2 пробірки наливають по 1 мл джерела амілази, в одну з них додають 1 мл буфера з рН 5,0; у другу – 1 мл буфера з рН 6,8. Потім в обидві пробірки приливають по 2 краплі йоду і по 1 мл крохмалю. Пробірки закривають пробками і залишають їх при кімнатній температурі, спостерігають за швидкістю зникнення синього забарвлення в кожній пробі. Відзначають, при якому значенні рН швидше гідролізувався крохмаль.

Примітка: якщо під дією двох крапель йоду крохмаль не посинів, додають ще однакову кількість розчину крохмалю в усі пробірки, доки не з’явиться синє забарвлення.

3. Вивчення впливу активаторів та інгібіторів на активність ферментів

В організмі дія ферментів регулюється різноманітними механізмами: інтенсивністю синтезу каталітичних білків генетичним апаратом, їхнім руйнуванням продуктами реакції каталізу, гормонами і іншими факторами.

Важлива роль належить активаторам та інгібіторам ферментів, які впливають на різні їхні ділянки або беруть участь в утворенні тимчасових комплексів із субстратами.

Активатори та інгібітори дії ферментів використовуються для регуляції відповідних технологічних процесів, наприклад, для заміса тіста, а також, в медичній практиці для припинення життєдіяльності мікроорганізмів або заміщення недостатньої активності ензимів у тканинах, наприклад, у підшлунковому соку.

Об’єкт дослідження: Розчин панкреатину (джерело амілази).

Обладнання і посуд: Штатив із пробірками.

Реактиви: 1. NaCl, 1 %-й розчин;

2. Сірчанокисла мідь, 5 %-й розчин;

3. Розчин йоду у йодистому калії, 0,004 н.;

4. Крохмаль, 1 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

Готують три пробірки. У першу приливають 2,5 мл води, у другу – 2 мл води та 0,5 мл розчину NaCl, у третю – 2 мл води та 0,5 мл розчину CuSO₄. В усі три пробірки вносять по 2,5 мл розчину амілази, перемішують і додають по 1 мл розчину крохмалю, потім знов перемішують і ставлять у термостат при температурі 37⁰ С. Через 5…10 хвилин додають по 5 крапель розчину йоду. Рідина у першій пробірці забарвлюється у фіолетовий або червоний колір, у другій – в червоний або жовтий, у третій – у синій.

4. Визначення специфічності дії ферментів

Ферментам притаманна специфічність дії, оскільки вони здатні каталізувати тільки певні хімічні реакції.

Специфічність дії ферментів буває абсолютна, відносна, групова і стереохімічна.

Ферменти специфічні відносно як типу реакцій, що каталізуються, так і субстратів, на які вони діють. Деяким ферментам притаманна абсолютна специфічність, що виявляється з дії тільки на один будь-який субстрат. Висока специфічність ферментів визначається тим, що тільки деякі строго визначені функціональні групи, що входять до складу ферментів, можуть брати участь в утворенні фермент-субстратних комплексів.

Амілаза слини прискорює гідроліз тільки полісахаридів, не впливаючи на дисахариди. Мальтаза слини прискорює гідроліз дисахарида мальтози, що утворюється при гідролізі крохмалю, але зовсім не впливає на інший дисахарид – сахарозу. Сахароза не має вільної альдегідної групи, тому не дає реакції з реактивом Фелінга. Реакція може бути позитивною тільки в тому разі, якщо сахароза розщепиться на свої складові – глюкозу і фруктозу. Сахарозу розщеплює фермент сахараза на глюкозу і фруктозу і не розщеплює крохмаль та інші дисахариди.

Об’єкт дослідження: 1. Розчин панкреатину (джерело амілази);

2. гідролізат дріжджів.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Термостат або водяна баня 38^оС;

3. Крапельниці;

4. Піпетки.

Реактиви: 1. Сахароза, 1 %-й розчин;

2. Крохмаль, 1 %-й розчин;

3. Їдкий натр, 10 %-й розчин;

4. Сульфат міді, 5 %-й розчин;

5. Реактив Фелінга І;

6. Реактив Фелінга ІІ.

Техніка виконання роботи

У дві пробірки приливають по 5 крапель 1 мл розчину амілази.У першу пробірку додають 1 мл 1 %-го розчину крохмалю, у другу – 1 мл 1 %-го розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять на 10 хв. у термостат або водяну баню при температурі 38^оС, після чого проводять реакцію Фелінга, тобто в обидві пробірки додають 0,5 мл реактиву Фелінга І і 0,5 мл Фелінга ІІ і нагрівають до кипіння.

Позитивна реакція Фелінга має місце в пробірці, де зустрічаються субстрат та відповідний фермент (наприклад, крохмаль та амілаза слини), результатом дії якого є гідроліз. При цій реакції утворюються мальтоза, а потім глюкоза, яка має вільну альдегідну групу, що забезпечує появу червоного осаду закісі міді.

Сахароза не має вільної альдегідної групи і відновлювальними властивостями не володіє, тому не дає реакції з реактивом Фелінга (червоного осаду). Реакція може бути позитивною тільки в тому разі, якщо сахарозу розщепить фермент сахараза на її складові – глюкозу і фруктозу.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 6

«ОКИСНЮВАЛЬНО-ВІДНОВЛЮВАЛЬНІ ФЕРМЕНТИ (ОКСИДОРЕДУКТАЗИ)»

Мета заняття: вивчити вплив різних факторів на активність оксидоредуктаз.

План заняття

1. Вивчити окислення формальдегіду дегідрогеназою молока.

2. Виявити вплив підвищеної температури на активність перок-сидази хріну.

3. Дослідити властивості рибофлавіну утворювати зворотню окислювально-відновлювальну систему.

4. Визначити роль поліфенолоксидази овочів у зміні їх забарв-лення.

Клас оксидоредуктаз включає ферменти, що беруть участь в окисленні та відновлюванні різних речовин. Окислення може здійснюватися декількома шляхами:

1. АО + ½ О₂ АО₂ (приєднання кисню);

2. АН₂ + В А + ВН₂ (відняття водню);

3. А²⁺ А³⁺ + е^­0 (відняття електрона).

Ферментам цього класу належить важлива роль у диханні та бродінні. До оксидоредуктаз належать, зокрема, дегідрогенази, оксидази і пероксидази.

Дегідрогенази. Дегідрогенази каталізують окислення субстрату шляхом відняття від нього водню, тобто перенесення водню від донора (здатного до окислення субстрату) на відповідний акцептор. Акцептором може бути кисень або будь-яка речовина, що міститься у тканинах організму. У дослідах використовують штучний акцептор – метиленову синь (МС). Дегідрогеназа відбирає водень від субстрату і віддає його МС, яка відновлюється і перетворюється в безбарвну сполуку (МСН₂). Отже, обезбарвлення розчину може свідчити про дію дегідрогенази. Лейкоформа (МСН₂) легко окислюється киснем повітря, тому досліди проводять при відсутності повітря ( у пробірках Тунберга або звичайних пробірках під шаром рослинної олії).

Оксидази. Окислення різних субстратів за рахунок кисню повітря каталізують оксидази. До цієї групи ферментів належать поліфенолоксидаза і тирозиназа. Саме дією поліфенолоксидази пояснюється потемніння поверхні розрізаного яблука або картоплини. Цей фермент окислює полі- і монофеноли, дубильні речовини та інші органічні сполуки з утворенням темнозабарвлених продуктів. Тирозиназа бере участь в окисленні амінокислоти тирозину до темного пігменту меланіна («мелас» – від грецьк. чорний).

Пероксидаза. У лабораторіях широко використовують метод визначення активності пероксидази, в основу якого покладено окислення пірогалолу в присутності перекису водню до пурпурогаліну, що утворює в розчині червоно-бурий осад.

1. Окислення формальдегіду дегідрогеназою молока

У молоці містяться дегідрогенази, що потрапляють із молочної залози та з мікрофлори молока. Альдегіддегідрогеназа окислює формальдегід до мурашиної кислоти.

Об’єкт дослідження: Молоко (джерело ферменту).

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Водяна баня на 40^оС;

3. Годинник або секундомір.

Реактиви: 1.Формальдегід, 0,4 %-й розчин;

2. Метиленова синь (МС), 0,001 %-й розчин;

3. Трихлороцтова кислота, 20 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

В одну пробірку вливають 5 мл кип’яченого молока, у другу – 5 мл свіжого. В обидві пробірки додають 0,5 мл розчину формальдегіду та 3 краплі розчину МС. Вміст струшують і пробірки розташовують у водяній бані (40⁰С). Фіксують час, необхідний для знебарвлення МС. Активність дегідрогенази виражають у хвилинах, необхідних для знебарвлення МС. Одержані результати записують і роблять висновок.

Одержані результати записують і пояснюють.

У всіх дослідах з дегідрогеназами використовували ТХО або високу температуру для інактивації ферменту. Ці фактори незворотне денатурують ферментний білок, тому при послідуючій інкубації в оптимальних умовах активність ферментів не виявлялася (контрольний варіант дослідів).

2. Вплив температури на активність пероксидази хрону

Об’єкт дослідження: Екстракт хрону.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Палички скляні;

3. Піпетки;

4. Термостат.

Реактиви: 1. Пірогалол, 1 %-й розчин;

2. Перекис водню, 2 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

Щоб визначити вплив температури на активність пероксидази, проводять досліди при 0...4^оС (холодильник) та 37^оС (термостат).

В пробірку вносять 1 мл розчину перекису водню й 1,5 мл розчину пірогалолу. Вміст пробірки доводять до заданої температури (нагріваючи або охолоджуючи), а потім додають 1,5 мл екстракту хрону, заздалегідь термостатованого при тій самій температурі в окремій пробірці. Вміст пробірки постійно перемішують скляною паличкою. Заміряють час до появи червоно-бурого осаду. Активність пероксидази виражають у секундах, необхідних для появи забарвлення.

3. Дослідження властивості рибофлавіну утворювати зворотню окислювально-відновлювальну систему

Об’єкт дослідження: Рибофлавін.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Гумові або коркові пробки.

Реактиви: 1. Рибофлавін, 0,015 %-й розчин;

2. НСl, концентрована;

3. Цинк, шматочки.

Техніка виконання роботи

У пробірку наливають 1 мл розчину рибофлавіну, потім додають 5 крапель НСl та шматочок цинку. Закорковують і залишають на 10...20 хв. спостерігають зникнення жовтого кольору рибофлавіну. Спочатку під впливом виділяющогося водню колір розчину поступово змінюється: спочатку з жовтого на зелений, а потім на рожевий і поступово обезбарвлюється (рибофлавін відновлений). Через 10...20 хвилин спостерігають появу жовтого кольору розчину (рибофлавін окислений).

4. Визначення ролі поліфенолоксидази в зміні забарвлення овочів та впливу на них гіпосульфіту натрію

Під впливом цього ферменту з циклічних амінокислот, що входять до складу білків картоплі, утворюються темнозабарвлені сполуки, внаслідок чого він темніє.

Об’єкт дослідження: Сира картопля.

Обладнання і посуд: Парцелянові ступки з товкачиками.

Реактиви: Гіпосульфіт натрію, 0,1 н розчин.

Техніка виконання роботи

У дві ступки кладуть по шматочку картоплі (1...2 г) і розтирають до однородної маси. Потім в першу ступку додають 2...3 мл розчину гіпосульфіту Na та перемішують. Сполуки залишають на повітрі на 15...20 хв., потім фіксують зміну забарвлення у кожній ступці.

Контрольні запитання

1. Яка роль ферментів в організмі?

2. Розповідайте про будову ферментів й їхніх активних центрів.

3. Якими властивостями володіють ферменти?

4. Як впливають на активність ферментів фізичні й хімічні фактори?

5. Чим обумовлена специфічність дії ферментів? Види специфічності.

6. Які номенклатура й класифікація ферментів?

7. Охарактеризуйте різні класи ферментів.

8. Які процеси харчових виробництв засновані на дії ферментів?

9. Які ферменти застосовуються в консервній промисловості?

10. Які ферменти застосовуються в м‘ясопереробній промисловості?

11. Які ферменти застосовуються в крохмале-патоковій промисловості?

12. Яка роль біологічного окислювання для процесів життєдіяльності організму?

13. Які розходження біологічного окислювання й окислювання в неживій природі?

14. Назвіть групи ферментів, що приймають участь у біологічному окислюванні.

15. Як побудовані анаеробні і аеробні дегідрогенази?

16. Розповісти про ролі гемінових ферментів у біологічному окислюванні.

17. Як здійснюється транспорт електронів і протонів у біологічному окислюванні?

18. Які речовини є кінцевими продуктами біологічного окислювання?

19. Чим відрізняються окислені форми НАД і ФАД від відновлених?

20. При підвищенні функції щитовидної залози різко збільшується утворення тепла, підвищується температура тіла. Які біохімічні процеси обумовлюють це явище?