Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ, ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 1 страница




Цель занятия. Ознакомить студентов с вакцинами различных типов, лечебно-профилактическими и диагностическими иммун­ными сыворотками, антигенами, аллергенами и принципами их контроля.

Оборудование и материалы. Вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2, против сальмонеллеза из штамма ТС-177, против лептоспироза, ботулизма, пастереллеза, лечебно-профилактичес­кие иммунные сыворотки против пастереллеза, рожи свиней, ди­агностические агглютинирующие и флуоресцирующие сальмонеллезные сыворотки, диагностические аллергены — бруцеллин, туберкулин, маллеин, стерильные МПА, МПБ, среда Китта—Тароцци в пробирках, агар Сабуро, стерильные пипетки Пастера, физиологический раствор, нефлуоресцирующее иммерсионное Масло, люминесцентный микроскоп, сенсибилизированные бру-целлами морские свинки с положительной реакцией ГЗТ.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Вакцины. Эти биологические препараты содержат в качестве активного начала цельные микробные клетки или их компонен­ты. Вакцины предназначены для создания искусственного актив­ного иммунитета. Различают несколько основных типов вакцин против инфекционных болезней сельскохозяйственных живот­ных.

Вакцины инактивированные корпуску­лярные содержат в качестве иммуногенного начала цельные инактивированные микробные клетки. При конструировании вакцин в их состав включают штаммы одного или нескольких сероваров в зависимости от антигенной гетерогенности конкрет­ного возбудителя. Используют штаммы бактерий без признаков диссоциации. Бактериальную массу чаще получают, культивируя вакцинные штаммы в жидких питательных средах в ферменте­рах. На следующем этапе бактериальные клетки инактивируют физическими (прогревание при 55...60°С, ультразвук, ультрафио­летовое облучение, ионизирующее излучение) или химическими методами (применяют такие средства, как формалин, глутаровый альдегид, бета-пропиолактон, кристаллвиолет, метиленовый си­ний и т.д.). К любому методу инактивации микроорганизмов предъявляют два основных требования: 1) 100%-я инактивация клеток возбудителя; 2) отсутствие существенных нарушений в антигенных и иммуногенных свойствах клетки возбудителя.

После инактивации устанавливают необходимую концентра­цию микробных клеток в 1 мл суспензии (концентрированием или, наоборот, разбавлением), корректируют рН, добавляют тот или иной адъювант, препарат расфасовывают и контролируют.

Анатоксинвакцины содержат в качестве иммуно­генного начала инактивированный формалином токсин бакте­рий. При ряде токсикоинфекций иммунитет в основном анти­токсический (ботулизм), обусловленный выработкой антител против бактериального экзотоксина. Для получения анатоксин-вакцин токсинобразующий штамм возбудителя культивируют в жидкой питательной среде в условиях, обеспечивающих макси­мальное накопление токсина в культуральной жидкости. Затем экзотоксин освобождают от бактерий, добавляют к нему форма­лин и выдерживают смесь в тепле. Под воздействием формали­на токсин переходит в нетоксическую форму (анатоксин), кото­рая сохраняет иммуногенные свойства. В качестве адъюванта в вакцинах подобного типа обычно используют гидроксид алю­миния.

Анавакцины: при производстве некоторых вакцин мик­робную массу и токсин не разделяют, и готовый препарат содер­жит инактивированные микробные клетки и анатоксин.

Химические вакцины в качестве иммуногенного начала содержат извлеченные тем или иным способом из мик­робной клетки различные химические соединения. Полученные вещества должны сохранить иммуногенные свойства, т. е. быть протективными антигенами. К преимуществу химических вак­цин относят возможность отделить иммуногенный компонент от балластных веществ клетки, что позволяет снизить реактогенность препарата. В принципе к химическим вакцинам можно от­нести и анатоксинвакцины.

Живые вакцины — искусственно ослабленные или природные авирулентные (слабовирулентные) штаммы возбудите­ля, которые утратили способность вызывать у естественно-вос­приимчивых животных болезнь, но могут в течение определенно­го промежутка времени размножаться в организме вакцинирован­ного животного, вызывая иммунный ответ. Два основных требо­вания к вакцинным штаммам: 1) отсутствие склонности к реверсии (возвращению в исходное вирулентное состояние); 2) неконтагиозность (возбудитель вакцинного штамма не должен передаваться от вакцинированного животного к невакцинированному). Желательно, чтобы вакцинный штамм нес стабильный маркер, отличающий его от эпизоотических штаммов возбудителя.

Искусственного ослабления вирулентности штамма (аттенуация) достигают многократными пассажами штамма через пита­тельные среды, организм невосприимчивых животных, воздей­ствием физических, химических факторов. Достаточно широко стали применять в качестве вакцинных штаммов ауксотрофные мутанты, не способные синтезировать некоторые жизненно важ­ные соединения, и поэтому, обеспечив иммунный ответ, доволь­но быстро погибающие в организме животного.

Генно-инженерные вакцины получают, искус­ственно вводя в клетку микроорганизма определенный ген (на­пример, контролирующий синтез определенного фактора пато­генности или другого протективного антигена), что в конечном итоге обеспечивает необходимую иммуногенность вакцинного препарата. В качестве передатчика генов (вектора) обычно ис­пользуют плазмиды или фаги.

Адъюванты (англ. adjuvant— помогающий) широко ис­пользуют при конструировании вакцин. Это вещества антигенной и неантигенной природы, различные по химическому соста­ву, которые при совместном с антигеном введении в организм вызывают неспецифическое стимулирование иммуногенеза. Из адъювантов неорганической природы наиболее часто используют гидроксид алюминия — минеральный гель; алюмокалиевые квас­цы, хорошо сорбирующие антигены.

К числу наиболее сильных адъювантов относят легкие мине­ральные масла со стабилизатором — безводным ланолином. Вак­цины с такими адъювантами называют эмульгированными (масляными).

Приготовление адъювантных вакцин состоит в добавлении к готовому микробному антигену соответствующего адъюванта в предварительно установленных оптимальных пропорциях.

Контроль вакцин. Вакцины всех типов после приго­товления проверяют в основном по трем параметрам.

Стерильность (инактивированные) или чистоту роста (живые) контролируют посевом на питательные среды.

Безвредность проверяют введением вакцины тем или иным лабораторным животным. Вакцина не должна вызывать заболе­вание и гибель животных.

Активность (иммуногенность) обычно контролируют следую­щим образом: вакцину вводят группе лабораторных животных, и через промежуток времени, достаточный для выработки актив­ного иммунитета (15...20 сут), эту группу вместе с контрольной группой непривитых животных заражают заведомо летальной до­зой возбудителя. Контрольные животные должны погибнуть, 80 % и более вакцинированных должны выжить. В некоторых случаях об иммуногенности препарата судят по косвенным пока­зателям: количеству агглютининов у привитых животных (лептоспирозная вакцина), антитоксинов в РН (вакцина против боту­лизма).

Например, сухую живую вакцину против рожи свиней ВГНКИ из штамма ВР-2 контролируют следующим образом.

Для контроля чистоты сухую (лиофилизированную) вакцину разводят стерильным физиологическим раствором в соотноше­нии 1: 10. Из суспензии бактерий готовят мазки, красят по Граму, микроскопируют. В препарате должны быть типичные мелкие грамположительные палочковидные клетки при отсутствии посто­ронних микроорганизмов. Одновременно проводят высевы на МПА, МПБ, среду Китта—Тароцци и агар Сабуро. Посевы выдер­живают при 37...38°С 10 сут, посевы на грибы — при 20...25 ºС 15 сут. Рост посторонней микрофлоры в указанные сроки на всех питательных средах должен отсутствовать при наличии типичного роста на МПА и в МПБ культуры возбудителя рожи.

С целью контроля вакцины на безвредность и активность 20 белым мышам массой 17...18 г вводят подкожно 0,2 мл препарата. Вакцину считают безвредной, если погибает не более 5 мышей. Через 14 дней всех оставшихся в живых вакцинированных и пять контрольных мышей заражают культурой вирулентного штамма возбудителя рожи свиней в заведомо летальной дозе. Вакцину признают активной, если погибают в течение трех-четырех суток контрольные и выживает не менее 75 % вакцинированных мы­шей.

Лечебно-профилактические иммунные сыворотки и иммуногло­булины. Данные биопрепараты применяют для создания пассив­ного иммунитета при профилактике или лечении. Под пассив­ной иммунизацией понимают введение готовых иммуноглобули­нов (антител) животному. Пассивный иммунитет возникает че­рез 20...24ч после инъекции и длится максимум две-три недели. Иммунные сыворотки получают путем многократного введения антигена животным-продуцентам (волам, лошадям и т.д.). Для получения каждого типа иммунных сывороток разработаны рег­ламенты приготовления соответствующего антигена, схемы им­мунизации и методы, с помощью которых контролируют количе­ство антител в сыворотке крови.

По направленности действия иммунные сыворотки подразде­ляют на антибактериальные, антитоксические, антивирусные. По достижении необходимого уровня антител у животного берут кровь обычно в объеме 1 % массы животного или осуществляют тотальное обескровливание. Полученную кровь сепарируют для получения сыворотки, которую стерилизуют фильтрованием и консервируют 0,25...0,5 % фенола, 0,01...0,03% тиомерсала или другими веществами.

Контроль сывороточных препаратов. Включает в себя проверку на стерильность, безвредность и спе­цифическую активность.

Стерильность препаратов проверяют посевом на питательные среды (МПА, МПБ, МППБ, агар Сабуро или Чапека).

Безвредность каждой серии обычно контролируют введением сыворотки морским свинкам. Специфическую активность сыво­ротки проверяют в зависимости от направленности ее действия.

Определение превентивных (защитных) свойств на естественно-восприимчивых или лабораторных животных заключается в том, что животным вводят подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно сыворотку, а через 20...24ч иммунизированным и контрольным животным вводят подтитрованную дозу гомоло­гичного вирулентного микроорганизма. Иммунизированные жи­вотные должны остаться здоровыми при гибели или характерном переболевании контрольных.

Активность антитоксических и ряда противовирусных сыво­роток определяют в реакциях нейтрализации. Количество анти­тел в сыворотках устанавливают при помощи различных сероло­гических реакций (РСК, РА, РИГА, РДП и т.д.).

Пример контроля иммунной сыворотки (против рожи свиней).

Контроль стерильности: сыворотку высевают на МПА, МПБ, МГТГТБ, агар Сабуро. Посевы выдерживают при 37 и 20 °С (Сабуро) десять дней. Среды должны остаться стерильными.

Контроль безвредности: пяти белым мышам массой 17...20 г вводят подкожно по 0,5 мл сыворотки, двум морским свинкам массой 250...300 г — по 10 мл. Все привитые животные должны остаться живыми в течение десяти дней.

Контроль активности: пятнадцати белым мышам массой 17...20 г вводят внутрибрюшинно по 0,01, 0,02 и 0,03 мл (по пять мышей на дозу) сыворотки. Через 2 ч всем привитым и пяти непривитым мы­шам вводят подкожно 0,1...0,2 мл суточной культуры вирулентного штамма возбудителя рожи свиней, разведенной 1:200. Сыворотку считают активной, если в течение десяти дней все привитые живот­ные остаются живыми, а контрольные погибают (допускается ги­бель двух белых мышей, привитых в дозе 0,01 мл).

Для концентрирования антител иммунной сыворотки, удале­ния серологически неактивных белков и соответственно повы­шения специфической активности препарата применяют мето­ды, с помощью которых выделяют глобулиновую фракцию бел­ков иммунной сыворотки. Готовые препараты иммуноглобули­нов контролируют, как и иммунные сыворотки: на стерильность, безвредность и специфическую активность.

Диагностические антитела. Принцип получения диагности­ческих иммунных сывороток такой же, как и лечебно-профилак­тических. Диагностические сыворотки должны характеризовать­ся не только высокой активностью в серологических реакциях, но и специфичностью. С помощью диагностических сывороток обнаруживают микробные антигены в тканевых материалах и идентифицируют выделенные микроорганизмы. В зависимости от целевого назначения можно говорить о видовых сыворотках (предназначенных для идентификации микроорганизмов на уровне вида), групповых (идентификация на уровне серологичес­кой группы), серовариантных (на уровне серовара). Иммунные сыворотки готовят для использования в различных серологичес­ких реакциях (РА, РП, РДП, РСК, РИГА, РН). При получении антител, меченных флуорохромом и ферментами, из иммунных сывороток предварительно выделяют и очищают иммуноглобулиновую фракцию. В целом диагностические сыворотки (анти­тельные диагностикумы) контролируют на стерильность, актив­ность и специфичность.

Пример контроля диагностической сы­воротки (люминесцирующей сальмонеллезной). Определе­ние активности (красящий титр): схема титрования сальмонел­лезной сыворотки показана в таблице 16.

Из 24-часовых агаровых гомологичных культур сальмонелл го­товят мазки (негустые), фиксируют их, затем на каждый мазок наносят различные разведения флуоресцирующей сыворотки. В дальнейшем препараты обрабатывают, как описано в теме 18.

Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Максимальное разведение сыворотки, обеспечивающее свечение гомологичных микробных клеток на три-четыре креста, считают ее красящим титром. Рабочий титр, т. е. используемый в работе, равен половине красящего. Красящий титр для групповых сыво­роток должен быть не ниже 1:32, для комплексной —1:16.

Контроль специфичности люминесцирующей сыворотки: аналогичным образом на предметных стеклах готовят мазки из гетерологичных сальмонелл и эшерихий (по нескольку культур). Флуоресцирующую сыворотку используют в рабочем титре. Све­чения гетерологичных микробов практически не должно быть.

Получение моноклональных антител. Обычные иммунные диагностические сыворотки, выпускаемые биофабриками, представляют собой смесь антител против раз­личных антигенных детерминант возбудителя инфекционной бо­лезни. Использование таких сывороток для идентификации воз­будителя сопряжено с получением перекрестных реакций между есроварами одного вида и даже между различными видами мик­роорганизмов за счет общих антигенных детерминант. Избежать таких нежелательных перекрестных реакций пытаются различ­ными способами. Один из методов заключается в использовании в качестве антигенов для иммунизации животных-продуцентов компонентов клеток возбудителя, несущих преимущественно специфические антигены. Часто такие вещества получают, раз­деляя антигенную смесь фильтрованием через сефадексы.

Другое традиционное направление в получении специфичес­ких реагентов — метод адсорбции иммунных сывороток, когда перекрестно реагирующие антитела удаляют, насыщая сыворот­ку клетками антигенно родственных бактерий. Клетки бактерий связывают перекрестно реагирующие антитела и потом их вместе с антителами отделяют от адсорбированной сыворотки центри­фугированием. Подобным образом получают адсорбированные агглютинирующие сыворотки для идентификации сальмонелл и некоторых других видов бактерий.

В качестве специфических антительных реагентов все чаще используют моноклональные антитела. Обычные диагностичес­кие сыворотки — поликлональные, поскольку содержат антите­ла, синтезированные разными линиями (клонами) В-лимфоцитов к различным антигенным детерминантам. Моноклональные антитела представляют собой иммуноглобулины, продуцируемые одним клоном клеток и реагирующие с определенным антиген­ным эпитопом микроорганизма.

Чтобы получить моноклональные антитела, изолируют и под­держивают линию лимфоцитов, синтезирующих антитела опре­деленной специфической направленности. Клетки-продуценты антител не способны расти in vitro. Злокачественная опухоль (миелома) синтезирует в больших количествах аномальные иммуно­глобулины и способна к неограниченному росту in vitro. Была разработана методика слияния клеток миеломы с лимфоцитами, при этом гибридная клетка (гибридома), как и опухолевая, спо­собна к неограниченному росту и одновременно синтезирует ан­титела, как лимфоидная. Задача сводится к обнаружению клона клеток, продуцирующих антитела необходимой специфической направленности. Получение моноклональных антител включает в себя несколько этапов.

Известным антигеном иммунизируют животных. Затем из се­лезенки выделяют В-лимфоциты.

Проводят слияние (гибридизацию) В-лимфоцитов и миеломных клеток. Получают смесь лимфоцитов гибридных и миеломных клеток.

Смесь клеток культивируют в среде, содержащей ГАТ (гипоксантин—аминоптерин—тимидин), что приводит к гибели лим­фоцитов и миеломных клеток, так как на указанной среде могут расти только гибридомы.

Гибридомные клетки рассевают (клонируют) таким образом, чтобы в лунке панели для микрокультивирования оказалась толь­ко одна клетка, дающая начало клону. После размножения кле­ток оценивают их способность синтезировать нужные антитела (проводят скрининг). Клонирование повторяют. В конечном итоге выбирают стабильный клон, продуцирующий антитела за­данной специфичности.

Клетки гибридом можно длительно хранить в замороженном состоянии (в жидком азоте).

Моноклональные антитела выделяют либо из культуральной жидкости (клетки гибридомы выращивают in vitro), либо из асцитической (выращивание in vivo).

Моноклональные антитела используют для диагностики ин­фекционных болезней в иммуноферментном, радиоиммунном и иммунофлуоресцентном анализах.

Диагностические антигены. Предназначены для постановки различных серологических реакций с целью серодиагностики ин­фекционных болезней животных. В зависимости от типа сероло­гической реакции антигены могут быть корпускулярными (РА, РСК), на носителях (эритроцитарные антигенные диагностикумы для РИГА), растворимые (РП, РДП). Технология приготовле­ния антигенов разнообразна, но основой для антигенов любого типа служат исходные селекционированные, без признаков дис­социации культуры микроорганизмов.

Контроль диагностических антигенов при выпуске проводят по следующим параметрам.

Контроль стерильности (см. вакцины).

Антиген для серологических реакций должен находиться в оп­ределенной оптимальной концентрации, выраженной, напри­мер, количеством микробных клеток в 1 мл.

Активность антигена определяют в той или иной серологичес­кой реакции с заведомо положительной сывороткой. Антиген должен давать четкую положительную реакцию. В некоторых случаях сначала устанавливают предельный титр антигена — раз­ведение, в котором он дает положительную реакцию с наиболь­шим разведением стандартной положительной сыворотки. Для постановки серологической реакции при диагностических иссле­дованиях используют рабочий титр антигена — двойную дозу предельного титра (единый бруцеллезный антиген).

Специфичность антигена испытывают в серологической реак­ции с заведомо отрицательной сывороткой.

Корпускулярные антигены для серологических реакций оса­дочного типа контролируют на спонтанную агглютинацию — вы­падение в осадок в отсутствие антител.

Пример контроля диагностического ан­тигена (бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с мо­локом).

Используют клетки бруцелл стандартной концентрации, окра­шенные гематоксилином.

Контроль стерильности: см. контроль вакцин.

Контроль специфичности и активности (табл. 17). Берут 10 проб свежего молока от здоровых коров. Молоко каждой пробы исследуют с разными количествами положительной бруцеллез­ной сыворотки.

Антиген признают специфичным, если во всех пробирках, в которые не добавляли положительную сыворотку, получен отри­цательный результат — молоко окрашено, заметно белое кольцо отстоявшихся сливок. Антиген признают активным, когда во всех трех пробирках каждой пробы с позитивной сывороткой или в пробирках с 0,15 и 0,1 мл сыворотки получен четкий положи­тельный результат — молоко белое, слой сливок синего цвета.

Диагностические аллергены. Данные биопрепараты (бруцеллин, туберкулин, маллеин) представляют собой экстракты из клеток возбудителя и содержат продукты их метаболизма. Аллер­гическая диагностика основана на выявлении гиперчувствитель­ности замедленного типа, которая развивается при ряде инфек­ционных болезней, особенно хронических. В основе этих диаг­ностических тестов лежит специфическая реакция иммунного воспаления с участием сенсибилизированных Т-лимфоцитов.

Пример контроля диагностических ал­лергенов (бруцеллина, предназначенного для диагностики бруцеллеза).

Контроль стерильности: см. контроль вакцин.

Контроль безвредности: бруцеллин в объеме 0,5 мл вводят в область спины белым мышам массой 18...25 г. В течение десяти дней животные должны остаться живыми и без воспалительной реакции на месте инъекции.

Контроль специфичности: морским свинкам белой масти в депилированный участок боковой поверхности туловища внутрикожно вводят бруцеллин в объеме 0,1 мл и сравнивают с эта­лонным препаратом. При учете результатов через 24 и 48 ч на месте инъекции не должно быть аллергической реакции. Кроме того, десяти здоровым овцам бруцеллин вводят под кожу нижне­го века по 0,5 мл (пальпебрально) и внутрикожно в подхвостовую складку по 0,2 мл. Контролем также служит эталонный аллерген. Аллерген считают специфичным, если у здоровых животных ал­лергических реакций не возникает. Кроме того, проверяют ал­лерген на антигенные свойства, для этого у овец через 10... 15 сут после введения аллергена исследуют в РА и РСК сыворотку кро­ви — антител не должно быть.

Контроль активности: 10... 15 белым морским свинкам вводят подкожно (0,25... 1) • 109 клеток штамма В. melitensis Rev-l для ал­лергической сенсибилизации. Через четыре недели в депилированный участок кожи вводят 0,1 мл исследуемого бруцеллина и в качестве контроля эталонный аллерген. Реакцию учитывают че­рез 24 ч, измеряя диаметр эритем (отека).

Интенсивность реакции на исследуемый и эталонный аллер­гены должна быть одинаковой.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести контроль чистоты и безвредности живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2.

2. Изучить образцы инактивированных сорбированных, эмуль­гированных и живых вакцин.

3. Провести контроль активности и специфичности люминес-цирующих сальмонеллезных сывороток.

4. Учесть результаты бруцеллиновой кожно-аллергической пробы на сенсибилизированных морских свинках.

Контрольные вопросы

1.Какие различают типы вакцин?

2.Что такое адъюванты?

3.Как контролируют вакцины, лечебно-профилактические и диагностические иммунные сыворотки?

4.В чем заключается преимущество диагностических препаратов на основе мо-ноклональных антител?

 

Тема 21

ОТБОР, КОНСЕРВИРОВАНИЕ, ТРАНСПОРТИРОВКА И ХРАНЕНИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ. ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Цель занятия. Ознакомить студентов с общими правилами от­бора, консервирования, транспортировки и хранения материалов для микробиологического исследования. Рассмотреть этапы мик­робиологического исследования.

Оборудование и материалы. Кролик, иглы для взятия крови, центрифужные пробирки, центрифуги, 96%-й этанол, ватные там­поны, глицерин, физиологический раствор, лед, поваренная соль, термос, термометр, труп животного (кролик, морская свинка), кю­веты с парафином или доски для вскрытия животных, пинцеты, ножницы, склянки для патологического материала, схемы бакте­риологического исследования при диагностике болезней бактери­альной этиологии (бруцеллез, стафилококкоз и т.д.).

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Отбор материала для микробиологического исследования. Пра­вильный отбор материала и его транспортировка в значительной мере определяют успех исследований.

Материал берут с учетом клинических признаков болезни, ко­торые указывают на поражение той или иной системы, патолого-анатомической картины при вскрытии (изменения в различных органах — печени, легких, кишечнике и т. д.), а также основыва­ясь на предполагаемом диагнозе, поскольку для каждой инфек­ции характерна определенная локализация возбудителя в орга­низме.

Материал для исследования берут прижизненно или посмерт­но (от павших или убитых с диагностической целью животных). Во всех случаях желательно материал брать от животных, не под­вергавшихся лечению антибиотиками, и в максимально короткие после их гибели сроки, так как через 2...3ч после смерти нор­мальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани, что затрудняет выделение возбудителя в виде чистой культуры. Что­бы избежать контаминации посторонней микрофлорой, исследу­емый материал берут стерильно, с использованием стерильного инструмента и посуды для транспортировки.

Трупы мелких животных направляют в лабораторию цели­ком.

Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая требования асептики. Каж­дый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транспор­тируют в нативном виде или консервируют одним из способов.

Трубчатые кости очищают от мышц, сухожилий, за­ворачивают в ткань, смоченную 5%-м раствором фенола, или пе­ресыпают поваренной солью и затем заворачивают в ткань.

Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца.

Кровь рекомендуют брать при лихорадочных состояниях стерильным шприцем в количестве 15...20 мл. Кровь, а также другие жидкие материалы можно отбирать стерильной пастеров­ской пипеткой с последующим запаиванием ее кончика.

Моча: наружные половые органы обмывают, ополаскива­ют стерильным физиологическим раствором, осушают стериль­ным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, пос­ледующую в необходимом количестве набирают в стерильную посуду.

Мокрота: собирают до приема корма. Из трахеи берут при помощи стерильного трахеотубуса и стерильного ватного тампо­на на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении там­пона возникает кашель и удается получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным фи­зиологическим раствором. При взятии материала из носоглотки используют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны.

Секрет молочной железы: сосок обмывают во­дой, обрабатывают этанолом, ополаскивают стерильным физио­логическим раствором, сцеживают и удаляют первую порцию секрета, для микробиологического исследования берут последу­ющие порции молока.

Спинномозговая жидкость: обычно берут при наличии менингоэнцефалитического синдрома путем пункции.

Кишечник: если исследуют содержимое кишечника, то пересылают отдельные отрезки (сегменты) кишечника, перевя­занные на концах лигатурами. В остальных случаях интересую­щие отрезки кишечника освобождают от содержимого, промыва­ют стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или насыщенным раствором хло­рида натрия. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с ре­гионарными лимфатическими узлами.

Фекалии берут стерильными ватными или ватно-марле-выми ректальными тампонами, которые вводят на 8...10 см в прямую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирую­щие смеси. В противном случае нарушается исходное количе­ственное соотношение микробных видов и размножение некото­рых бактерий может привести к инактивации искомого возбуди­теля.

Консервирование, транспортировка и хранение материала. Ма­териал помещают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, флаконы, банки и т. д.), закупоривают.

При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с мате­риалом помещают в герметичный металлический пенал (ящик), который опечатывают.

Транспортировку и хранение материала до исследования про­водят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопут­ствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганиз­ма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) поме­щают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиоло­гического раствора или помещают в термос, содержащий: 1) снег или лед и поваренную соль (в соотношении 3:1), температура смеси — 15...-20 ºС; 2) равные части сухого льда и этанола, тем­пература смеси около —70 °С.

Для консервирования материала, содержащего энтеробактерии, используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема.

Глицериновая смесь: глицерин — 500 мл, физиоло­гический раствор — 1000 мл, рН смеси доводят до 7,8...8,0 добав­лением 20%-го раствора гидрофосфата калия. Смесь стерилизуют дробно, текучим паром.

Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода— 1000мл, дигидрофосфат калия —0,45г, гидрофосфат ка­лия — 5,34 г. Стерилизуют при 121 °С 20 мин.

Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магниевая, желчный бульон), которые должны со­ставлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервиро­вания фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2...6°С.

В сопроводительном документе указывают: название и адрес хозяйства, фамилию ветеринарного работника, направляющего материал, вид животного, от которого материал получен, харак­тер материала, на какую инфекцию необходимо исследовать. Кроме того, прилагают протокол патологоанатомического вскрытия и описание клинико-эпизоотологических данных.






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 188. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.093 сек.) русская версия | украинская версия