Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ





Реакция преципитации (РП), как и реакция агглютинации, принадлежит к разряду серологических реакций осадочного типа, но в отличие от РА в ней используют не корпускулярные, а растворимые антигены микроорганизмов. Образование комплек­сов антиген — антитело сопровождается изменением оптической плотности среды (помутнением) — преципитацией (от лат. praecipitatio — падение вниз), что расценивают как положитель­ный результат реакции.

Антиген для РП готовят из чистых культур микроорганизмов, если антиген предназначен для серодиагностики, или из ткане­вого материала, содержащего микроорганизмы, если РП ставят, чтобы при помощи известной иммунной сыворотки обнаружить возбудитель в патологическом материале.

Физические методы экстрагирования антигенов основаны на механическом разрушении микробных клеток посредством рас­тирания с кварцевым песком, встряхивания на шюттель-аппарате в колбе со стеклянными шариками, многократного заморажи­вания и оттаивания или воздействия ультразвуком. Полисахаридные термостойкие антигены выделяют термической обработкой (кипячением, автоклавированием).

Из химических методов получения антигенов достаточно ши­роко используют экстрагирование трихлоруксусной кислотой (полный антиген Буавена); кислотный или щелочной термогид­ролиз—прогревание материала, например, в 1%-м растворе ук­сусной кислоты или 0,1 н. растворе гидроксида натрия; экстраги­рование при помощи ацетона, мочевины, этилового спирта, эфира и других растворителей; часто применяют различные детергенты — дезоксихолат натрия, лаурилсульфат натрия и т.д.; используют методы ферментативного разрушения микробных клеток, например, посредством воздействия трипсином.

Выбор того или иного способа выделения растворимого анти­гена зависит от его химической природы. Главное требование к любому из методов — эффективное извлечение антигена без его денатурации.

На основе феномена преципитации разработаны реакция кольцепреципитации (РКП), реакция диффузионной преципита­ции (РДП), радиальной иммунодиффузии; принцип реакциипреципитации использован в иммуноэлектрофорезе и встречном имщноэлектрофорезе.

Реакция кольцепреципитации (РКП). Известна по имени автора как реакция Асколи (1911); разработана для диагностики сибирс­кой язвы. РКП используют в ветеринарной диагностической практике преимущественно для выявления микробных антиге­нов в тканевом материале. Обязательное условие постановки РКП — прозрачность раствора антигена и иммунной сыворотки, поэтому при необходимости компоненты реакции освобождают от взвешенных частиц фильтрованием, например, через асбесто­вую вату.

Техника постановки РКП включает в себя три варианта.

Метод «наслаивания» антигена. В уленгутовские пробирки (диаметр 2...3 мм) вносят пастеровской пипеткой с тонким ка­пилляром, не смачивая стенок пробирки, 0,3...0,4 мл иммунной преципитирующей сыворотки. Затем по стенке пробирки осто­рожно наслаивают на поверхность сыворотки 0,1...0,2 мл раство­римого исследуемого антигена (преципитиногена). Смешивания компонентов не происходит благодаря различию плотности сы­воротки и экстракта.

Учет результатов проводят на фоне темной бумаги. Через 1...2мин в зоне взаимной диффузии антигена и антител, на гра­нице контакта компонентов, происходит помутнение среды, ви­димое сбоку как серо-белый диск (преципитат).

Метод «подслайвания» антител. В пробирку вначале вносят антиген, а затем осторожно при помощи пастеровской пипетки на дно пробирки, под антиген, «подслаивают» иммунную сыво­ротку.

При постановке кольцевой РП в ходе исследования тканевого материала необходимы следующие контроли: 1) иммунная сыво­ротка + стандартный антиген; 2) иммунная сыворотка + физио­логический раствор; 3) иммунная сыворотка + экстракт из тка­ней здоровых животных.

Показания РП считают достоверными, если в первом контро­ле получают положительный, а в остальных — отрицательный ре­зультат (рис. 61).

Микровариант РКП. Разработан для экономии компонен­тов. В этом случае используют стеклянные капилляры или тонко оттянутые кончики пастеровских пипеток диаметром 0,5... 1 мм. Капилляр опускают одним концом во флакон с пре­ципитирующей сывороткой, набирают ее на высоту 1...1,5 см, закрывают верхнее отверстие капилляра указательным паль­цем. Затем ватой удаляют излишек сыворотки с наружной сто­роны капилляра, погружают его в раствор антигена и набира­ют равное количество антигена. Капилляр переворачивают с таким расчетом, чтобы смесь сыворотки и антигена оказалась в середине капилляра, после чего закрепляют вертикально в пластилиновой пластинке. Результаты учитывают, как и при обычной РКП.

Реакция диффузионной преципитации (РДП). Основана на встречной диффузии антител (иммунной сыворотки) и раствори­мых антигенов в агаровом геле (двойная диффузия). Если анти­ген состоит из смеси моноантигенов, то каждый из них диффун­дирует с различной скоростью и точки эквивалентных соотноше­ний каждого антигена и гомологичных антител будут находиться в различных участках агарового геля, где и формируется преци­питат в виде линий. Таким образом, каждая пара антиген — ан­титело образует свою линию преципитации. При помощи РДП можно анализировать сложные антигенные смеси, поскольку каждый антиген дает свою линию преципитации. В ряде случаев РДП используют как метод серологической диагностики инфек­ционных болезней.

Из очищенного агара фирмы «Дифко» готовят 1,5%-й раствор агара в физиологическом растворе (рН 7,2...7,4) с добавлением мертиолата (конечное разведение 1:10 000) как консерванта.

На хорошо обезжиренное стекло, лежащее строго горизон­тально, наливают расплавленный агар в количестве, достаточном для формирования слоя геля толщиной 3...4 мм. Затем штампами вырезают лунки в агаровом геле; агар из лунки удаляют с помо­щью трубочек. На дно лунки вносят каплю горячего агара с пос­ледующим его удалением, что создает «дно» лунки и предотвра­щает подтекание компонентов под гель.

В зависимости от конкретной задачи применяют штампы с различным количеством пробойников, обеспечивающие полу­чение лунок разного диаметра и на разном расстоянии. При изучении неизвестных реагентов оптимальное расстояние меж­ду лунками необходимо установить в предварительных опытах. В зависимости от конкретной задачи в центральную лунку вно­сят иммунную сыворотку, в периферические — анализируемые нтигены или наоборот. Сыво­ротка и антиген не должны выходить за пределы лунки на поверхность агара. Затем плас­тины помещают в эксикатор. На дно эксикатора наливают небольшое количество воды с антисептиком. Пластины с компонентами выдерживают при комнатной температуре 10..,72 ч (рис. 62).

Учет результатов: полосы преципитации образуются только в зоне эквивалентнос­ти, т. е. там, где все антитела связаны с антигеном. (Если в жидкой среде соединить экви­валентные количества реаген­тов, то в надосадочной жидко­сти после формирования пре­ципитата не будет свободных антигена и антител.)

При изучении в РДП раз­личных антигенов возможны три варианта результата реакции (рис. 63, 64, 65).

1. Реакция идентичности: слияние линий преципитации, от­носящихся к двум соседним антигенам (у сравниваемых антиге­нов гомологичные детерминанты — антигены оценивают как идентичные).

2. Реакция неидентичности: пересечение линий преципита­ции (у сравниваемых антигенов нет гомологичных антигенных детерминант).

3. Реакция неполной идентичности: неполное пересечение линий преципитации с формированием так называемой «шпо­ры». Такая картина возникает, когда у одного из антигенов по­мимо гомологичных есть и специфические детерминанты, кото­рые второй антиген в составе своей молекулы не несет.

 

С помощью реакции диффузионной преципитации можно об­наруживать антитела в сыворотке крови и определять их титр. В этом случае в центральную лунку вносят известный растворимый антиген (бактериальный, вирусный), а в периферические — раз­личные разведения исследуемой сыворотки крови (рис. 66).

Чтобы полосы преципитации стали более выраженными, плас­тины обрабатывают солями кад­мия: пластины с готовым гелем отмывают в физиологическом растворе и заливают 0,65%-м ра­створом сульфата кадмия. В ре­зультате через несколько минут полосы преципитации стано­вятся более ярко выраженными (в несколько раз).

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Метод электрофоретического разделения антигенных смесей в агаровом геле с последующим выявлением отдельных антиге­нов при помощи реакции диффузионной преципитации. Иммуноэлектофорез применяют для изучения состава сложных антигенных смесей, например микробных растворимых антигенов, белков сыворотки крови и т.д.

Для приготовления агарового геля и заполнения кювет электрофоретической камеры используют различные буферные ра­створы: 1) веронал-мединаловый (барбитуратный) буферный ра­створ, рН 8,6, ионная сила 0,05; веронал — 1,84 г, мединал— 10,3 г, дистиллированная вода —до 1000 мл; 2) трис-буфер, рН 8,9; трис (оксиметил)-аминометан — 60,5 г, этилендиаминотетра-уксусная кислота — 6 г, борная кислота — 4,6 г, дистиллирован­ная вода — до 1000 мл.

Существует много других буферных растворов, различающих­ся по значениям рН и ионной силе. Ионная сила (р.) равна поло­вине суммы произведения концентрации каждого иона, присут­ствующего в растворе, на квадрат его валентности. Чем ниже ионная сила буфера, тем быстрее двигаются белки, но чрезмер­ное снижение ионной силы ухудшает разделение компонентов.

Для проведения электрофореза расплавленный гель наливают на стеклянные пластины размером (13...18) х (18...24) см (макро­метод) или на предметные стекла (микрометод) слоем толщиной 2...4 мм. Затем в агаровом геле с помощью пробойников выреза­ют лунки для растворов, подлежащих электрофоретическому раз­делению. Если объем жидкости достаточно велик (макрометод), то ее предварительно диализируют против буферного раствора, который используют для электрофореза.

Подготовленную пластину помещают в камеру для электро­фореза (рис. 67, 68). Слой агара на пластине благодаря агаровым «мостикам» или полоскам хроматографической бумаги сообщает­ся с анодной и катодной кюветами, заполненными буферным раствором. Ток через выпрямитель поступает на пластину с агаром (напряжение обычно 300...500 В и силой тока 30...40 А). Если гра­диент потенциала на агаровой пластине составляет 5...6 В/см, то на пластине длиной 18 см разгонка белков завершается за четыре-пять часов, при меньших размерах пластины разгонка проис­ходит быстрее.

 

По истечении указанного времени пластину с гелем вынима­ют из камеры, в агаре по длине пластины прорезают траншею, которую заполняют иммунной сывороткой. Пластины помещают во влажную камеру. Образование дуг преципитации завершается через несколько сугок-(рис. 69). Электрофореграммы можно вы­сушивать на стеклах, окрашивать или при помощи специальных реактивов определять химическую природу веществ в дугах пре­ципитации.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Освоить технику постановки и учета результатов кольцевой
РП и РДП.

2. Изучить метод иммуноэлектрофореза, иммунофореграммы.

Контрольные вопросы

1.В чем сущность феномена преципитации?

2.Какова техника постановки кольцевой РП и РДП?

3.Для каких целей применяют метод иммуноэлектрофореза?

 

Тема 17

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

Цель занятия. Ознакомить студентов с принципом и техникой постановки реакции связывания комплемента.

Оборудование и материалы. Физиологический раствор, 2,5%-я суспензия эритроцитов барана в физиологическом растворе, бру­целлезный антиген, положительная бруцеллезная сыворотка, нормальная сыворотка крупного рогатого скота, комплемент морской свинки, гемолизин, мерные пипетки на 1,5 мл, водяная баня.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Помимо серологических реакций осадочного типа (РА, РП) в диагностике инфекционных болезней широко используют реакцию связывания комплемента (РСК), в которой факт взаимодействия антигена и антитела устанавливают при помощи специальной ин­дикаторной системы, которую лизирует комплемент. Механизм иммунного лизиса с участием комплемента рассмотрен в теме 15.

РСК применяют как метод серологической диагностики и реже для обнаружения микробных антигенов в исследуемом ма­териале. В РСК с одинаковым успехом можно использовать кор­пускулярные и растворимые антигены.

Комплемент (С) не способен соединяться с антигеном (АГ) или с антителами (AT) в отдельности, но реагирует с образовав­шимся комплексом АГ – AT. В РСК участвуют две системы: АГ – AТ и комплемент.

Исследуемая АГ – АТ-система: искомый компонент (напри­мер, антитела) в ней может количественно варьировать или пол­ностью отсутствовать. При взаимодействии комплемента с сис­темой АГ - AT видимые феномены отсутствуют.

Индикаторная АГ - АТ-система состоит из эритроцитов бара­на (антиген) и гемолизина (антитела к эритроцитам барана). При взаимодействии комплемента с системой АГ - AT наблюдают процесс иммунного лизиса эритроцитов. На конкуренции иссле­дуемой и индикаторной систем АГ - AT за комплемент основана диагностическая РСК. Рассмотрим ее принцип на модели обна­ружения антител в исследуемой сыворотке при помощи извест­ного антигена.

РСК ставят в два этапа. Сначала в пробирку вносят исследуе­мую сыворотку крови, известный антиген и комплемент. Смесь реагентов выдерживают в водяной бане при 37 °С 20...30 мин. Независимо от результата видимых изменений в пробирке не происходит (первая фаза РСК). Чтобы выяснить результат, в пробирку вносят индикаторную систему (вторая фаза РСК). Пос­ле инкубирования всех компонентов учитывают результаты. Воз­можны два варианта результатов.

 

Антитела в исследуемой Комплекс АГ-АТ-С не образовался, С остался в

сыворотке отсутствуют активном состоянии и способен реагировать с другим

комплексом АГ-АТ, т.е. лизировать индикаторную

систему

 

Антитела в исследуемой Образовался комплекс АГ-АТ-С, комплемент

Сыворотке присутствуют инактивирован, при внесении в пробирку

Индикаторной системы ее лизис не происходит

 

Компоненты РСК. При введении всех компонентов в строго определенном количественном соотношении реакция дает дос­товерные и воспроизводимые результаты.

Солевой раствор для разведения компонентов: ис­пользуют физиологический раствор. Более стабильные результа­ты иммунного гемолиза получают при введении в раствор ионов Са2+ и Mg2+, поскольку они необходимы для эффективного дей­ствия системы комплемента.

Эритроциты барана: эритроциты дефибринированной крови барана отмывают физиологическим раствором (2500 мин-1 три раза по 5 мин). В реакции обычно используют 2,5%-ю суспензию. При необходимости длительного использова­ния ее хранят в растворе Ольсвера: хлорид натрия — 4,2 г, ли­монная кислота — 0,55 г, цитрат натрия — 8 г, декстроза — 20,5 г, дистиллированная вода—10мл (рН 6,1). Раствор стерилизуют автоклавированием и смешивают с кровью в соотношении 1 : 2. Эритроциты, хранящиеся в растворе Ольсвера при 4...6°С, мож­но использовать в течение З0...40сут.

Гемолизин выпускают биофабрики. Представляет собой сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана, содержащую антитела к эритроцитам. На коробках с ге­молизином указывают его активность в виде титра, определенно­го в реакции иммунного лизиса.

Комплемент — сыворотка крови морской свинки. Био­фабрики выпускают комплемент в лиофилизированном виде (срок годности 1 год). В случае необходимости комплемент мож­но получить пункцией сердца морской свинки при помощи шприца с иглой.

Антиген: диагностические антигены для РСК готовят на биофабриках. На коробках с антигеном указывают его актив­ность (титр антигена) в виде разведения, рекомендованного для использования в РСК.

Титрование гемолизина. При достаточно длительном хранении необходимо определять активность гемолизина путем его титро­вания в реакции иммунного гемолиза. Результаты этого опыта показывают, в какой оптимальной концентрации необходимо вводить в РСК гемолизин, чтобы обеспечить работу индикатор­ной системы. Титром гемолизина называют его максимальное разведение, при котором в присутствии оптимального количе­ства комплемента гемолизин способен обеспечить полный лизис суспензии эритроцитов.

При титровании готовят вспомогательные разведения гемоли­зина (табл. 9). Их переносят в 8 пустых пробирок и добавляют другие компоненты (табл. 10).

 

 

 

В приведенном примере титр гемолизина составляет 1 : 2000 (4-я пробирка). Для постановки РСК обычно берут удвоенное количество гемолизина — в данном случае 1 : 1000 (рабочий титр).

Титрование комплемента. Комплемент титруют каждый раз в день постановки главного опыта РСК. За титр комплемента при­нимают его минимальное количество, которое вызывает полный лизис определенной дозы суспензии эритроцитов в присутствии рабочей дозы гемолизина. Комплемент титруют в гемолитичес­кой или бактериолитической системе. Титрование комплемента в гемолитической системе, например, может быть проведено по указанной схеме (табл. 11).

 

 

В нашем примере титр комплемента составил 0,1 мл. Актив­ность комплемента могут снижать антиген и исследуемая сыво­ротка (антикомплементарное действие). Чтобы нивелировать ан-тикомплементарность компонентов, комплемент берут в опыт на 20...40 % больше установленного титра. Для более точного опре­деления титра рекомендуют титровать комплемент в присутствии сыворотки крови и антигена (титрование в бактериолитической системе).

Например, при серодиагностике бруцеллеза комплемент тит­руют на негативной и позитивной сыворотках, полученных от животных того же вида, что и исследуемая сыворотка. Каждую сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1: 5 и прогревают в водяной бане для инактивации собственного комплемента: сыворотки крупного рогатого скота — при 60...62 ºС, лошадей —при 56...58 °С, буйволов —при 62...64°С, ослов и мулов —при 64...65 ºС, овец и коз —при 58...60°С 30 мин, свиней —при 60...62°С 50 мин.

Схема титрования комплемента в бактериолитической систе­ме показана в таблице 12.

Титром комплемента считают минимальное его количество, которое обеспечивает полный гемолиз суспензии эритроцитов в пробирках с негативной сывороткой и антигеном и позитивной сывороткой без антигена. В данном примере титр комплемента равен 0,1 мл (5-я пробирка). В качестве рабочего титра берут ко­личество комплемента на 0,02 мл больше, т. е. 0,12 мл.

Главный опыт РСК. Кроме исследуемых сывороток крови при постановке основного опыта РСК в качестве контрольных ис­пользуют положительную и отрицательную сыворотки крови. Все сыворотки предварительно разводят физиологическим раствором в соотношении 1 : 5 и прогревают при 56...64 ºС в водяной бане для инактивации собственного комплемента. Схема главного опыта показана в таблице 13.

Результат РСК учитывают по наличию или отсутствию гемо­лиза эритроцитов в пробирках и выражают в крестах: 1)(++++) — полная задержка гемолиза (после оседания эритро­цитов жидкость прозрачная); 2) (+++) — задержка гемолиза сильно выражена (после оседания эритроцитов жидкость слабо­розового цвета); 3) (++) — частичная задержка гемолиза (после оседания эритроцитов жидкость интенсивно окрашена в крас­ный цвет); 4) (+) — слабая задержка гемолиза (незначительный осадок эритроцитов, жидкость интенсивно окрашена); 5) (—) — полный гемолиз, осадка эритроцитов нет.

Как положительный результат РСК оценивают задержку гемо­лиза минимум на два креста и более.

Учет результатов начинают с контрольных пробирок:

7-я пробирка — контроль физиологического раствора: гемоли­за не должно быть;

6-я пробирка — контроль индикаторной системы и компле­мента: должен быть полный гемолиз;

5-я пробирка — контроль антигена: должен быть полный ге­молиз;

3-я пробирка — контроль с отрицательной сывороткой: дол­жен быть полный гемолиз;

2-я пробирка — контроль с положительной сывороткой: долж­на быть задержка гемолиза.

Если все перечисленные контроли свидетельствуют о пра­вильности приготовления компонентов реакции и выборе их доз, приступают к учету результатов РСК с исследуемой сывороткой крови.

Первоначально учитывают результаты в 4-й пробирке (безан­тигенный ряд) — контроль антикомплементарности сыворотки. При полном гемолизе в 4-й пробирке (отсутствие антикомпле­ментарности) можно учитывать результат в 1-й пробирке (анти­генный ряд), где результат может варьировать от полного гемо­лиза (отрицательный результат) до полной задержки гемолиза (положительный результат). Если исследуемая сыворотка антикомплементарна, то результат в первой пробирке учитывать нельзя и от этого животного необходимо брать кровь для повтор­ного исследования. Окончательный учет результатов РСК прово­дят через 18...20 ч, за это время нелизированные эритроциты осе­дают на дно пробирки.

В приведенном примере рассмотрен вариант постановки РСК в объеме 1 мл, когда каждый компонент взят в объеме 0,2 мл. Возможна постановка РСК в макроварианте (2,5 мл) или в капельном варианте.

Расчет количества компонентов для постановки РСК.Напри­мер, необходимо исследовать 100 сывороток крови. Сыворотку крови исследуют в разведениях 1 : 5, кроме того, с тем же разведе­нием ставят контроль на антикомплементарные свойства сыво­ротки (безантигенный ряд). Следовательно, на каждую сыворотку необходимо 2 пробирки, на 100 сывороток — 200 пробирок. РСК ставим в объеме 1 мл, и каждый компонент необходимо пригото­вить в объеме 40 мл (0,2*200): гемолизин в рабочем титре, антиген в рабочем титре, 2,5%-я суспензия эритроцитов барана.

Титр комплемента в нашем опыте составил 0,12 мл в разведе­нии 1 :20. Следовательно, на 200 пробирок необходимо 24 мл комплемента, разведенного 1:20 (0,12*200 = 24), а неразведенного — 1,2 мл (24 : 20 = 1,2). Ампула (флакон) обычно содержат 2 мл комплемента, и для проведения этого опыта достаточно вскрыть одну ампулу, взять из нее 1,2 мл комплемента и добавить к 38,8 мл физиологического раствора.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести титрование гемолизина и комплемента и опреде­лить их рабочие титры.

2. Поставить главный опыт РСК и учесть результаты.

Контрольные вопросы

1. Что представляет собой комплемент морской свинки? Как его консервиру-
ют?

2.На чем основано получение гемолизина?

3.В чем сущность иммунного гемолиза?

4.Что такое титр и рабочий титр гемолизина и комплемента?

5.Какова схема главного опыта РСК?

6.Для чего используют РСК?






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 773. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.089 сек.) русская версия | украинская версия