И ИММУНОЛОГИИ

Учебное пособие

 

Компьютерная верстка___Любская О.Г.

 

Технический редактор Киреев Д.А.

Ответственный за выпуск Морозов Р.В.

 

 

Бумага офсетная. Печать на ризографе

Усл. печ. л.____ Тираж _____экз. Заказ №______

 

 

Информационно-издательский центр МГУДТ

115998, Москва, ул. Садовническая, 33

тел./факс: 506-72-71

e-mail: idopost@yandex.ru

 

Отпечатано в ИИЦ МГУДТ

ПРАКТИКУМ ПО

ВЕТЕРИНАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

И ИММУНОЛОГИИ

 

Попущено Министерством сельского хозяйства Рос­сийской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений по специальнос­ти 310800 «Ветеринария»

 

 

Ф

МОСКВА «КОЛОС» 2001

 

 

Редактор В. В. Ракитская

 

Рецензент профессор П. Ф. Сонин (С.-Петербургская государственная акаде­мия ветеринарной медицины)

Костенко Т. С., Родионова В. Б., Скородумов Д. И. Практикум ветеринарной микробиологии и иммунологии. — М.: Колос, 2001. — 344 с: ил. — (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений). ISBN 5-10-003507-2.

 

Изложены методы бактериологических и серологических исследований, приведены схемы лабораторной диагностики бактериозов и микозов сельс­кохозяйственных животных.

Каждая тема содержит методические указания, перечень материалов, необходимых для проведения занятия, задания для самостоятельной работы и контрольные вопросы для самопроверки.

Практикум может быть полезен при проведении факультативных занятий. -

Для студентов вузов по специальности «Ветеринария».

 

УДК 616.9: 619(076.5)

ББК 48.73я73

 

ISBN 5-10-003507—2

 

Раздел I

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ: МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

•

Тема 1

ВЕТЕРИНАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ. ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия. Ознакомить студентов с назначением бактерио­логической лаборатории, ее основным оборудованием и прави­лами техники безопасности; с принципами фазово-контрастной, темнопольной, люминесцентной, электронной микроскопии. Освоить микроскопическое исследование бактериальных препа­ратов с применением иммерсионной системы. Изучить основ­ные формы бактерий и методику определения их размеров.

Оборудование и материалы. Термостаты, микроанаэростаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклавы, центрифуги, ваку­умные насосы, дистиллятор, водяные бани, потенциометр (рН-метр), фильтры, лабораторная посуда, световой, люминесцент­ный и электронный микроскопы, темнопольный конденсор, фазово-контрастное устройство, окуляр- и объект-микрометры, го­товые препараты с бактериями, иммерсионное масло.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Ветеринарно-бактериологическая лаборатория. Это учреждение Государственной ветеринарной службы РФ. Различают район­ные, межрайонные, областные (краевые) и республиканские ла­боратории. В их задачи входят: проведение бактериологических, серологических, вирусологических, микологических, биохими­ческих, патологоанатомических и других исследований для уста­новления лабораторного диагноза болезней животных всех ви­дов, проведение экспертизы молока, мяса и других пищевых продуктов и кормов.

Лаборатории размещают в специальном здании с дифферен­циацией на отделы. Например, для межрайонных и районных ветеринарных лабораторий предусмотрены бактериологический, серологический и химико-токсикологический отделы. Выделяют помещение для вивария, где содержат экспериментальных жи­вотных (мыши, морские свинки, кролики и т. д.), а также баранакак донора крови, необходимой для приготовления питательных сред и постановки серологических реакций (РСК). Зараженных и здоровых животных содержат в разных комнатах вивария.

В бактериологической лаборатории оборудуют боксы. Под них отводят отгороженную стеклянной переборкой часть помещения или две-три смежные комнаты. В боксе работают, когда необхо­димо предотвратить контаминацию (загрязнение) окружающей среды патогенными микроорганизмами или исследуемых культур посторонней микрофлорой. Перед работой воздух и стенки бокса обеззараживают ультрафиолетовыми лучами бактерицидных ламп.

В отдельных помещениях лабораторного корпуса моют посу­ду, инструменты (моечная), готовят питательные среды (бакте­риологическая кухня), стерилизуют посуду, среды, спецодежду, обеззараживают культуры бактерий и инфекционный материал (автоклавная).

Правила техники безопасности в ветеринарно-бактериологической лаборатории. Работа в бактериологических лабораториях со­пряжена с опасностью заразиться самим или заразить других па­тогенными микроорганизмами. Для студентов ветеринарных ву­зов лабораторией служит кафедра микробиологии. Сотрудники бактериологических лабораторий и кафедры микробиологии, ас­пиранты, студенты, приходящие на занятия или для работы в на­учно-студенческих кружках, обязаны ознакомиться с правилами техники безопасности и строго их соблюдать.

Входить в помещение лаборатории и работать в ней разреша­ется только в специальной одежде — халате и головном уборе (шапочка, косынка). Халат должен быть застегнут, волосы подо­браны.

Не разрешается вносить посторонние предметы; личные вещи (портфели, сумки) оставляют в отведенных для этой цели местах.

Категорически запрещается курить и принимать пищу.

Перед началом работы проверяют исправность приборов (га­зовых и спиртовых горелок). О всех неисправностях сообщают ответственному лицу лаборатории, на учебных занятиях — пре­подавателю.

Не разрешается зажигать одну горелку от другой во избежание взрыва. Для зажигания горелок используют только спички.

Электроприборы включают с разрешения преподавателя или обслуживающего персонала кафедры. Запрещается касаться про­водов и контактных частей электросети.

Рабочее место и оборудование содержат в чистоте, соблюдают опрятность в работе.

Исследуемый материал должен рассматриваться как особо опасный. При работе с ним необходимо соблюдать принятые в микробиологической практике технические правила, исключаю­щие возможность заражения работника.

Движение культур микроорганизмов (посев, хранение, унич­тожение) регистрируют согласно действующей инструкции в специальном журнале.

В случае попадания материала или культур микроорганизмов на пол, стол и т. д. обрабатывают эти поверхности дезинфициру­ющим раствором.

После окончания работы использованный материал (патоло­гический материал, бактериальные, грибные культуры, инстру­менты и др.) студенты отдают преподавателю или лаборанту для обеззараживания, рабочее место тщательно убирают и дезинфи­цируют; моют и дезинфицируют руки, халаты и головные уборы складывают в полиэтиленовые пакеты.

После ознакомления с правилами техники безопасности на кафедре микробиологии студенты расписываются в журнале пре­подавателя.

Основное оборудование диагностических бактериологических ла­бораторий. Лаборатории в обязательном порядке оснащены сле­дующим оборудованием.

Термостат используют для культивирования микроорга­низмов в аэробных условиях. Это шкаф с двойными стенками, пространство между которыми заполнено водой или воздухом; снабжен устройством для поддержания постоянной температуры в диапазоне 28...43 °С (стабильную температуру лучше поддержи­вают водяные термостаты).

Микроанаэростаты необходимы для культивирова­ния клеток в анаэробных условиях (см. тему 7); представляют со­бой герметические емкости, из которых с помощью насоса уда­ляют воздух и затем помещают в термостат.

Печь Пастера и автоклав служат для стерилиза­ции инструментов, лабораторной посуды, питательных сред, спецодежды и т. д. Их устройство и принцип работы подробно изложены в теме 6.

Холодильники бытовые (4...6 °С) и низкотемператур­ные (-20 °С и ниже) используют для хранения питательных сред, культур микроорганизмов, вакцин, сывороток, поступившего для бактериологического исследования материала.

Центрифуги настольные, рефрижераторные (для разделения компонентов в условиях низких температур), микроцент­рифуги предназначены для осаждения микроорганизмов, отделе­ния форменных элементов от плазмы крови и др.

Помимо перечисленного оборудования в лаборатории необхо­димы: вакуумные насосы, дистиллятор, технические и аналити­ческие весы, водяные бани, потенциометр, керамические, асбес­товые и мембранные фильтры, аппараты для изготовления ватно-марлевых пробок, лабораторная посуда — чашки Петри, бак­териологические и серологические пробирки, пластиковые планшеты для культуральных работ и микротитрования, колбы, мерные цилиндры, матрацы, градуированные и пастеровские пи­петки, специальные инструменты — бактериологические петли, иглы, шприцы, пинцеты, шпатели, ножницы и т. д.

Техника микроскопирования. Микроскопы, дающие увеличе­ние в сотни (световой) или тысячи раз (электронный), использу­ют для изучения морфологии и строения микроорганизмов. Бак­териологические лаборатории снабжены микроскопами различ­ных типов: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др.

Световой микроскоп. Основные узлы световых микроскопов показаны на рисунке 1.

К механическим частям микроскопа относят штатив, состоя­щий из основания и тубу содержателя. К тубусодержателю 12 прикреплены: тубус 14, револьвер 18— вращающийся диск с гнездами для объективов и предметный столик 20 с клеммами 5, фиксирующими предметное стекло с изучаемым объектом. Тубус передвигают вверх-вниз при помощи макро- 2 и микрометричес­кого 1 винтов.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного ап­парата, зеркала, апертурной диафрагмы, конденсора, объективов и окуляров. Зеркало 23 подвижно закреплено под конденсором, одна его поверхность

плоская, другая — вогнутая. При работе с конденсором используют плоскую, без конденсора — вогнутую поверхность зеркала. Конденсор 21 применяют для концентри­рования отраженных зеркалом лучей света, фокус которых дол­жен находиться в плоскости препарата. Верхняя линза конденсо­ра плоско-выпуклая, нижняя — двояковыпуклая. Под конденсо­ром помещена апертурная (ирисовая) диафрагма 22. Изменяя диаметр отверстия, через которое проходит пучок света, регули­руют интенсивность освещения поля зрения.

Объективы 19 состоят из нескольких линз, заключенных в ме­таллическую оправу. Только одна линза — фронтальная — вы­полняет функцию увеличения, остальные предназначены для коррекции изображения. Под рабочим расстоянием объектива понимают расстояние от плоскости фронтальной линзы до изу­чаемого объекта при нахождении последнего в фокусе. Чем боль­ше увеличение объектива, тем меньше рабочее расстояние и поле зрения. На корпусе объектива обозначены его увеличивающая способность (х8, х20, х40, х90) и числовая апертура.

Числовая апертура отражает количество света, попадающего в линзу:

А = п sin и,

где А — числовая апертура линзы; п — показатель преломления среды, граничащей с линзой; и — половина отверстного угла а (рис. 2).

Окуляр 13 содержит глазную и собирательную линзы, которые увеличивают изображение, полученное при помощи объектива. На окулярах указано их увеличение (х5, х7, х10, х15). Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличе­ний окуляра и объектива: например, окуляр х10 и объектив х90 увеличивают объект в 900 раз. Важно получить не только увели­ченное, но и четкое изображение исследуемого объекта. Чет­кость изображения зависит от разрешающей способности микро­скопа, которую понимают как минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.

Разрешающая способность микроскопа зависит от числовой апертуры пользуемого света. Например, апертура объектива х40 состав­ляет 0, 65, конденсора — 1, 0, использован зеленый свет с длиной волны 0, 55 мкм, отсюда разре­шающую способность вычисляют по формуле

а = λ /(А₁+А₂),

где а — минимальное расстояние между двумя точками; Я —длина волны; А_х — числовая апертура объектива; Л₂ — числовая апертура конденсора.

 

Рис. 2. Схема хода лучей при разном значении угла а:

А — объект; О — объектив; и — половина отверстного угла

Следовательно, в приведенном примере а = 0, 55/(0, 65 + 1, 0) = = 0, 33 мкм, т. е. при этих условиях предел разрешения равен 0, 33 мкм.

Повысить разрешающую способность микроскопа можно за счет применения более коротких лучей света или, что более дос­тупно, за счет приближения показателя преломления среды, гра­ничащей с линзой, к аналогичному показателю стекла. С этой целью прослойку воздуха между линзой объектива и предметным стеклом замещают специальной жидкостью с показателем пре­ломления, близким к показателю преломления стекла. Особенно это необходимо при использовании объективов большого увели­чения (х 90 и больше) с фронтальными линзами малой площади. Показатель преломления стекла и воздуха составляет соответ­ственно 1, 52 и 1, 0, поэтому в качестве иммерсионных жидко­стей, создающих оптически однородную среду между предмет­ным стеклом и линзой объектива, применяют чаще всего кедро­вое масло (л= 1, 5), глицерин («= 1, 4), воду («= 1, 3). Ход лучей света при использовании обычного (сухого) и иммерсионного объективов показан на рисунке 3. Объективы для масляной им­мерсии обозначают МИ, водной — ВИ.

 

Если апертура конденсора меньше апертуры рабочего объек­тива, то из-за слабого потока света возможности линзы объекти­ва задействованы не полностью. Если апертура объектива мень­ше, чем апертура конденсора, что характерно для объективов ма­лого увеличения, то уменьшают диаметр отверстия ирисовой ди­афрагмы конденсора.

Микроскопы необходимо хранить под чехлами или колпаками для защиты от пыли. Для наружной очистки оптики применяют смоченные спиртом мягкие ткани, не оставляющие после себя волокон. Использование ксилола и бензина для этих целей мо­жет привести к расклеиванию линз.

При микроскопировании существенное значение имеет осве­щение исследуемого объекта. Освещение чаще устанавливают по методу Келлера.

Осветитель (желательно использовать стандартные освети­тели ОИ-7 и ОИ-19, содержащие микролампу с небольшой плотно скрученной спиралью, которую можно передвигать вдоль оси осветителя) располагают на расстоянии 30...40 см от микроскопа.

На предметный столик ставят препарат, в рабочее положе­ние переводят объектив х8.

3. Конденсор поднимают до упора, полностью открывают
ирисовую диафрагму.

Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти пол­ностью закрывают диафрагму осветителя.

На зеркало помещают лист белой бумаги и, передвигая пат­рон осветителя, добиваются четкого изображения на бумаге нити накала лампы.

Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осветителя — светлое пятно с нерезко очерченными краями.

Используя объектив х 8, фокусируют объект в области свет­лого пятна.

 

Опуская конденсор, в плоскости препарата фокусируют изображение краев диафрагмы осветителя и движением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.

Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.

10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.

В работе с учебными микроскопами освещение нередко уста­навливают упрощенным способом. Приступая к работе с микро­скопом, проверяют состояние конденсора: он должен быть под­нят до уровня предметного столика, диафрагма открыта. При­подняв тубус микроскопа, устанавливают объектив с наимень­шим увеличением (х8, х10); глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полного освещения поля зрения. Затем на исследуе­мый препарат наносят каплю кедрового масла (или его замените­ля), помещают препарат на предметный столик, поворотом ре­вольвера устанавливают иммерсионный объектив. (Чтобы избе­жать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует дер­жать приподнятым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким поворотом макрометри­ческого винта погружают в каплю иммерсионного масла и, на­блюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до видимости пре­парата. Затем легкими поворотами микрометрического винта (вперед-назад) регулируют четкость изображения.

В конце работы тубус приподнимают макровинтом, револьвер переводят в нейтральное положение, масло с линзы осторожно снимают мягкой хлопчатобумажной тканью. Микроскоп убирают в деревянный футляр или накрывают стеклянным колпаком (лучше из цветного стекла) для защиты от света.

Микроскопированием определяют морфологические особен­ности микроорганизмов, их тинкториальные свойства, подвиж­ность, наличие специальных структурных элементов (спора, кап­сула).

Чтобы исследовать под микроскопом живые нефиксирован­ные неокрашенные микроорганизмы, используют особые опти­ческие системы: фазово-контрастное устройство и темнопольный конденсор.

Фазово-контрастное устройство. Включает в себя: а) фазовую пластинку — расположенный в задней фокальной плоскости объектива прозрачный диск, на поверхность которого напылено кольцо из металлов (фазовое кольцо); б) кольцевую диафрагму — помещенную под конденсором светонепроницаемую пластину с прозрачным кольцевидным участком.

Световая волна при прохождении через живую клетку отстает по фазе приблизительно на '/₄ длины волны и дополнительно сдвигается еще на 'Д после прохождения через фазовую пластин­ку. Ход лучей в фазово-контрастном устройстве показан на ри­сунках 4, 5. Сдвинутые по фазе после прохождения через фазо­вую пластинку лучи либо совпадают и складываются с прямыми лучами, идущими мимо объекта, либо оказываются в противофазе. В первом случае исследуемый объект виден как светлый на темном фоне, а во втором — как темный на светлом фоне. В микробиологии широко применяют фазово-контрастное устрой­ство КФ-4 (рис. 6) (объект виден темным на светлом фоне). Да­лее приведена последовательность перехода к работе с фазово-контрастным устройством.

Обычный конденсор заменяют на фазово-контрастный, а объектив х40 — на аналогичный фазовый объектив.

Диск револьвера конденсора поворачивают до появления в окошечке цифры 0; диафрагму конденсора полностью открыва­ют.

Используя объектив х8, устанавливают освещение по Кел­леру.

Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и с помо­щью тубуса добиваются четкого изображения фазовой пластинки в виде темного кольца.

5. Устанавливают кольцевую диафрагму, соответствующую
объективу х40. В этом случае наряду с темным кольцом фазовой пластинки можно видеть светлое кольцо диафрагмы.

При помощи центрировочных винтов совмещают фазовое кольцо и кольцо диафрагмы.

Вспомогательный окуляр заменяют обычным и микроскопируют препарат. При работе с другими объективами устанавли­вают соответствующие диафрагмы.

Темнопольный конденсор. При темнопольной микроскопии ис­пользуют специальный конденсор с затемненной центральной частью, поэтому в плоскость объекта идут только боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверхностей конденсо­ра. Лучи направлены под таким углом, что не попадают в линзу объектива, и поэтому поле зрения выглядит темным (рис. 7). Та часть лучей, которая попадает на объект, отражается в линзу объектива, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.

Чтобы перейти к методу темнопольной микроскопии, посту­пают следующим образом.

Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вывинчива­ют один из объективов (х 8).

Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить на­кала лампы на листе белой бумаги, помещенном на зеркале (см. п. 5 Установки освещения по Келлеру).

Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают матовым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добиваются равно­мерного освещения поля зрения.

Ставят на место окуляр, объектив х8, темнопольный кон­денсор, положение зеркала при этом не меняют.

На линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды, на столик помещают препарат «раздавленная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конденсора контактировала с ниж­ней поверхностью предметного стекла.

Глядя в окуляр, при помощи центрировочных винтов пере­водят в центр поля зрения светлое кольцо с темным пятном в центре. Далее регулируют видимость объекта в поле зрения.

Люминесцентный микроскоп {lumen — свет, escennt — слабое действие). Ветеринарно-бактериологические лаборатории снаб­жены люминесцентными микроскопами серии МЛ (рис. 8) и но­вой серии «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследовательского типа).

 

Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люминогены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на бо­лее высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбуж­денное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на ста­бильны низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо-, рентгенолюминесценцию.

В лабораторной практике в основном используют фотолюми­несценцию—свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратко­временную—флуоресценцию, быстро затухающую после пре­кращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресценцию, продолжающуюся и после окончания возбуж­дения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отлича­ется от света возбуждения большей длиной волны, поэтому при освещении объекта невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиолетовыми лучами получают длинноволновые све­чения объектов, хорошо видимые простым глазом.

Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первич­ная люминесценция присуща практически всем веществам, од­нако интенсивность свечения большинства из них невелика. В микробиологии чаще применяют вторичную люминесценцию: обрабатывают биологический объект (препарат) специальными красителями — флуорохромами (акридин оранжевый, аурамин, флуоресцеин, уранин, родамин и др.), которые обладают интен­сивной первичной люминесценцией. Флуорохромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при освещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами/В люминесцентных микроскопах источником возбуждения люминесценции служит ртутно-кварцевая лампа ДРШ-250. Что­бы провести успешную люминесцентную микроскопию: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помо­щью специальных светофильтров выделяют коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изу­чаемого объекта и отсекают лучи той же длины, что и лучи люми­несценции (в противном случае все поле зрения будет интенсив­но светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят светофильтры типов УФС-3, ФС-1, СС-4 и др., которые называют «возбуждающими» светофильтрами; 2) из све­тового потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропус­кают длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновре­менно защищают глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуж­дающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюда­теля помещают окулярные (запирающие) светофильтры типов ЖС-3, ЖС-18, Т-1Н и Т-2Н.

Сочетанное применение в оптической системе люминесцент­ного микроскопа фильтров целевого назначения (возбуждающие, запирающие) называют принципом скрещенных фильтров. Эф­фект скрещенных светофильтров обеспечивает цветную флуо­ресценцию объектов на темном фоне поля зрения (зелено-жел­тую).

Ход лучей в люминесцентном микроскопе показан на рисунке 9. Лучи от лампы ДРШ попадают на светоделительную пластин­ку, расположенную между объективом и окуляром. Ненужные длинноволновые лучи проходят через светоделительную плас­тинку и гаснут в кожухе микроскопа. Возбуждающие коротко­волновые лучи пластинка отражает на изучаемый объект. Часть возбуждающих лучей трансформируется на объекте в длинновол­новые лучи люминесценции, которые проходят через объектив, светоделительную пластинку, запирающие фильтры и попадают в глаз наблюдателя. Другую часть возбуждающих лучей, не пре­терпевших изменений, светоделительная пластинка отражает в сторону источника света —лампы ДРШ. Такое дифференцирую­щее свойство светоделительной пластинки обусловлено тем, что она покрыта несколькими слоями диэлектриков и расположена под углом 45° по отношению к падающим на нее лучам.

Существенное отличие серии «Люмам» от МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разными пара­метрами возбуждающего спектра и спектра люминесценции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильтрами и фильтрами возбуждающего света.

При люминесцентной микроскопии в качестве иммерсионной жидкости используют специальное нефлуоресцирующее масло (обычное иммерсионное масло для этих целей непригодно из-за собственной люминесценции).

Преимущество люминесцентной микроскопии заключается в том, что она дает цветное изображение, высокую степень кон­трастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах. В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флуорохромированных объектов и метод флуорес­цирующих антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекцион­ных болезней.

Электронный микроскоп. Длина волн видимой области спектра лежит в пределах 0, 4...0, 7 мкм, следовательно, максимальное раз­решение (половина длины волны), которое можно получить при помощи светового микроскопа, — около 0, 2 мкм (200 нм). Волно­вые свойства также присущи электронам. При напряжениях 50 ООО... 100 ООО В длина волны электрона составит 0, 0055... 0, 0039 нм. По чисто техническим причинам получить теоретичес­ки максимальное разрешение, равное 0, 002 нм, невозможно, и на практике оно не превышает 1...2 нм.

Основная часть электронного микроскопа включает в себя ряд магнитных линз, люминесцентный экран и фотографическую пластинку (рис. 10). Электрический ток проходит через вольфра­мовую нить и вызывает эмиссию электронов. К нити приложено высокое отрицательное напряжение, что обеспечивает большую разницу потенциалов между нитью и заземленной пластиной анода. В этом поле электроны движутся к аноду, часть из них проходит через отверстие в центре анода (центральная апертура) и формирует электронный луч, который фокусируется первой магнитной линзой (конденсорной) и освещает объект. Большая часть электронов проходит через объект без отклонения, часть электронов после столкновения с тяжелыми атомами выбивается из общего электронного луча. В итоге образуется такая структура электронного луча, которая при дополнительной фокусировке дает изображение

объекта. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной магнитной линзой, которая дает уве­личенное изображение; третья магнитная линза (проекционная), в свою очередь, также увеличи­вает изображение, которое и попадает на экран. Если люми­несцентный экран убрать, то луч попадает на фотопластинку.

Электронный микроскоп, создающий изображение при прохождении электронов через тонкопленочный образец, на­зывают трансмиссионным или просвечивающим.

В сканирую­щем электронном микроскопе первичный электронный луч, по­падая на поверхность фиксированного, высушенного и покрыто­го тонким слоем металла объекта, вызывает различные вторич­ные излучения, интенсивность которых зависит от характерис­тик рельефа, электропроводности и химического состава. Полез­ное увеличение сканирующей электронной микроскопии обычно не превышает 50 000 раз. С ее помощью получают трехмерное изображение объекта (рис. 11).

 

 

Основные формы бактерий. Форма бактерий различных таксо­номических групп разнообразна (рис. 12), и ее обязательно учи­тывают при идентификации микроорганизма.

Кокки. Это бактерии шаровидной формы. В зависимости от взаимного расположения клеток различают микрококки— отдельно лежащие кокки, диплококки — парно располо­женные кокки, стрептококки — цепочки кокков, ста­филококки— скопление кокков в виде виноградной грозди, тетракокки — структуры из четырех кокков, сарцины — многослойные структуры из 8... 16 кокков.

Палочковидные бактерии. Клетки цилиндрической формы, мо­гут располагаться одиночно, парами — диплобактерии, Цепочками — стрептобактериИ. Палочковидные бакте рии, образующие в неблагоприятных условиях специфическую форму существования — спору, диаметр которой не превышает диаметр клетки (аэробные палочковидные бактерии), называют бациллами. Если диаметр споры в клетке существенно пре­вышает ее поперечный диаметр, то такие спорообразующие бак­терии называют клостридиями (анаэробные палочки).

Извитые (спиралевидные) бактерии. К ним относят вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы — клетки в форме слегка изогнутых палочек; спириллы — бактерии, образующие до 6 завитков; спирохеты — бактерии со множеством (свыше 6) мелких завитков и в отличие от спирилл без жгутиков.

Ветвящиеся бактерии. Выраженная способность к ветвлению отмечена у прокариот из группы актиномицет; тенденцию к вет­влению на отдельных стадиях развития проявляют и другие бак­терии, например микобактерии.

Бактерии без постоянной формы. Микоплазмы лишены кле­точной стенки, поэтому их форма легко изменяется.

У большинства бактериальных клеток нет дифференциации на передний и задний концы, нижнюю и верхнюю стороны, т. е. функционально они равноценны, хотя есть исключения.

Полиморфизм. Это свойство некоторых видов бактерий в про­цессе роста на питательных средах образовывать формы, отлича­ющиеся от типичной.

Определение размеров микроорганизмов. Размеры бактерий ва­рьируют в широких пределах — от 0, 2 мкм (микоплазмы) до 125 мкм {Ochromotium oxaliferum). Размеры большинства патоген­ных бактерий составляют от нескольких десятых микрометра до нескольких микрометров.

При характеристике размеров бактерий обычно указывают длину и ширину клетки в микрометрах (10~³мм). В качестве инструментов измерения используют окуляр- и объект-микро­метры..

Окуляр-микрометр. Это стеклянная пластинка, на которой ли­ния в 5 мм разделена на 10 или 20 делений (размещают в окуляре).

Объект-микрометр. Представляет собой предметное стекло с линией длиной 0, 5 или 1, 0 мм, разделенной на сотые доли (рис. 13, 14).

 

Объект-микрометр помещают на предметный столик и, глядя в окуляр с окуляр-микрометром, совмещают начальную черту в объект- и окуляр-микрометрах. Затем определяют цену деления окуляр-микрометра при данных окуляре и объективе. Например: шкала объект-микрометра составляет 1 мм и одно ее деление равно 10^{-2 мм, т.е. 10мкм.}

При совмещении шкалы объект-микрометра три его деления (т. е. 30 мкм) соответствуют 14 делениям окуляр-микрометра, от­сюда одно деление окуляр-микрометра составляет 30: 14 = 2, 14 мкм. После того как определена цена одного деления оку­ляр-микрометра, вместо объект-микрометра помещают препарат с исследуемым объектом. Например, палочковидный микроб по длине занимает 3, а по ширине — 0, 5 деления окуляр-микромет­ра. Если одно деление окуляр-микрометра составляет 2 мкм, то длина бактериальной клетки будет 3-2 = 6 мкм, а ширина — 0, 5 • 2 = 1 мкм.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Ознакомиться с бактериологической лабораторией, ее ос­новным оборудованием, правилами техники безопасности.

Изучить устройство светового микроскопа, установку осве­щения по Келлеру, принципы фазово-контрастной, темнопольной, люминесцентной и электронной микроскопии.

3. Освоить приемы работы с иммерсионным объективом мик­роскопа.

Провести микроскопию препаратов с бактериями различ­ной формы.

Определить размеры бактериальных клеток.

 

Контрольные вопросы

1. Каковы основные правила работы в бактериальной лаборатории?

2. Как проходят лучи в иммерсионной системе, фазово-контрастном устройстве микроскопа, темнопольном конденсоре, люминесцентном микроскопе?

3. Каковы основные формы бактерий?

4. Как определяют размеры микроорганизмов?

 

 

Тема 2

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ

Цель занятия. Ознакомить студентов с основными бактерио­логическими красителями, техникой их приготовления и мето­дом простой окраски бактериальных препаратов.

Оборудование и материалы. Набор сухих бактериологических красок и их растворов, культуры бактерий на МПА и в МПБ (Е. coli, S. aureus), световые микроскопы, обезжиренные пред­метные стекла, фуксин Пфейффера, красящие бумажки по Си­неву, раствор метиленового синего, фильтровальная бумага для высушивания мазков, физиологический раствор.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Обычно форму, взаимное расположение, некоторые особенно­сти химического состава и строения бактериальных клеток опре­деляют путем микроскопии окрашенных препаратов. Оптическая плотность неокрашенных бактерий близка к оптической плотнос­ти стекла, поэтому бактерии плохо различимы при микроскопиро-вании. Окрашенные клетки, наоборот, четко видны. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы в процессе обработки инактивируются, что делает препарат безопасным для исследователя.

Отношение к различным красителям и методам окраски на­зывают тинкториальными свойствами микроорганизмов.

Бактериологические красители. Для окрашивания бактериаль­ных клеток применяют синтетические анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых — анион. Структуры бактерий, взаимо­действующие с красителем, преимущественно отрицательно за­ряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.

Основные красители. Красные (нейтральный красный, пиро-нин, сафранин, основной фуксин); фиолетовые (генциан фиоле­товый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, тионин); синие (виктория, метиленовый синий); зеленые (малахитовый зеленый, метиленовый зеленый, янус зеленый); коричневые (везувин, хризоидин); черные (индулин).

Кислые красители. Розовые и красные (кислый фуксин, эозин, эритрозин, гропеолин); желтые (аурантил, конго, пикриновая кислота); черные (нигрозин).

Спиртовые растворы. Эти растворы длительного хранения го­товят из сухих порошковых красок. Растворы сначала выдержи­вают в термостате для лучшего растворения веществ, затем филь­труют через бумажные фильтры, чтобы избавиться от нераство­рившихся микрочастиц, которые при окраске препаратов оседа­ют на клетках, тем самым затрудняя их изучение под микроско­пом.

Далее приведены рецепты спиртовых растворов красок, наи­более часто применяемых в микробиологии.

Карболовый фуксин Циля: раствор А: основной фуксин —0, 3 г, 96%-й этанол —10 мл; раствор Б: фенол — 5 г, вода дистиллированная — 95 мл. Растворы А и Б смешивают.

Фуксин Пфейффера — это