БАКТЕРИОФАГИ

Цель занятия. Ознакомить студентов с действием бактериофа­гов и их практическим использованием.

Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма L. monocytogenes, набор листериозных бактериофагов, стериль­ный МПБ, содержащий 0, 5 % глюкозы, 2%-й МПА в чашках Петри, стерильные пипетки Пастера, лечебно-профилактичес­кий бактериофаг против паратифа и колибактериоза телят, чув­ствительная к фагу культура Е. coli.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Бактериофаги представляют собой вирусы, адаптировавшиеся в процессе эволюции к паразитированию в прокариотических клетках (рис. 47). Репродукция многих бактериофагов в клетке приводит к ее лизису. На специфической адаптации фагов к строго определенным видам (штаммам) бактерий и внешнем проявлении поражения бактериальных клеток (лизис) основано практическое использование бактериофагов: при помощи извес­тного (диагностического) фага можно обнаружить и идентифи­цировать бактерии. Кроме того, биологическая промышленность выпускает лечебно-профилактические бактериофаги.

Определение литической активности бактериофага. У диагнос­тических и лечебно-профилактических фагов должна быть выра­жена литическая активность, которую определяют путем титро­вания фагов, например, в жидкой питательной среде.

В бактериологические пробирки разливают по 4, 5 мл стериль­ного МПБ; в первую пробирку вносят 0, 5 мл исследуемого фага, затем готовят его десятикратные разведения от 10~' до Ю-'0. К разведениям бактериофага добавляют по капле суточной бульон­ной культуры чувствительного к данному фагу вида бактерий, инкубируют при 37 °С 24 ч. За титр фага принимают его макси­мальное разведение, еще способное вызвать лизис бактерий — среда в пробирке прозрачна. Фаг считают активным при титре 10^-7, 10^-8

Рис. 47. Схема строения фага Т2 по данным электронной микроскопии: а — с нуклеиновой кислотой в головке: 1 — головка; 2— полая центральная часть; 3 — оболочка (расправленная); 4— базальная пла­стинка; б —без нуклеиновой кислоты в го­ловке: I — головка; 2 — оболочка (сокрашенная); 3 — хвостовые нити

Определение количества бактериофага (по методу Грациа). Го­товят десятикратные разведения исследуемого фага в физиологи­ческом растворе (10^-1…10^-2 и т.д.), затем из последнего разведе­ния, например 10^-7 или 10^-8, берут 0, 5 мл жидкости, смешивают с равным объемом чувствительной к данному бактериофагу буль­онной культуры бактерий. Полученную смесь добавляют к 4 мл расплавленного 0, 7%-го МПА (температура 45 °С), перемешива­ют и выливают на поверхность подсушенного питательного агара в чашку Петри. Аналогичным образом поступают со всеми разведениями бактериофага (10^-5, 10^-5 и т.д.). Чашки инкубируют в термостате при 37 º С 24 ч.

 

 

 

Учет результатов: не пораженные бактериофагом бактерии ра­стут и образуют сплошной газон на поверхности питательного агара. Клетки, пораженные фагом, лизируются, и в этой зоне можно видеть «стерильные» пятна на сплошном бактериальном газоне. Количество этих пятен («бляшек») соответствует количе­ству фаговых частиц в суспензии (рис. 48).

 

 

Применение фагов для идентификации бактерий. Фаги приме­няют для видовой идентификации бактерий (возбудитель сибир­ской язвы, листериоза и др.) или внутривидовой — установление фаговара конкретного бактериального штамма.

Для идентификации неизвестной культуры бактерий при по­мощи диагностического бактериофага обычно используют плот­ную питательную среду. Например, исследуемую 18-часовую культуру, предположительно листерий, засевают в МПБ с глюко­зой, инкубируют при 37 °С 4 ч до легкой опалесценции среды и затем засевают газоном (0, 1мл) на подсушенный 2%-й МПА в чашку Петри. Через 1... 1, 5 ч инкубирования посевов при 37 º С при слегка приоткрытой крышке на одну половину газона нано­сят каплю листериозного бактериофага 2А и на вторую половину помещают каплю фага 4А. Посевы инкубируют при 22...25 °С 16...24ч.

Учет результатов: если культура листериозная, то на месте нане­сения хотя бы одного фага можно видеть прозрачную зону лизиса.

Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты дан­ного вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен данный штамм, что и служит его маркером.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить активность лечебно-профилактического коли-па-ратифозного фага по отношению к исследуемой культуре Е. coli.

2. Провести идентификацию культуры L. monocytogenes при помощи листериозных диагностических фагов.

Контрольные вопросы

1.Что такое бактериофаг?

2.Как используют бактериофаги?

3.Какими методами титруют бактериофаги?