Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА МАКРООРГАНИЗМА




Цель занятия. Ознакомить студентов с методами тестирования факторов неспецифической резистентности и методами оценки иммунного статуса животного организма.

Оборудование и материалы. Культура Е. coli на МПА стериль­ный МПБ, стерилизатор, шприцы и иглы, спиртово-водный ра­створ метиленового синего, нормальная и иммунная (противо-эшерихиозная) кроличьи сыворотки, стерильные пастеровские пипетки, 1%-й агар Дифко, ацетоновый порошок М. lysodeicticus (или культура), стерильные чашки Петри, кристаллический лизо-цим, фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,2...7,4, эритро­циты барана, стерильный физиологический раствор, веронал-мединаловый буферный раствор с рН 7,3...7,4, гемолизин, компле­мент морской свинки, дистиллированная вода, фотоэлектроколориметр, пластины с результатами радиальной иммунодиффузии по определению иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови, калибровочная кривая для определения содер­жания иммуноглобулинов разных классов; препараты для под­счета Е-РОК и ЕАС-РОК.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Методы определения факторов неспецифической резистентнос­ти макроорганизма. Защиту макроорганизма от возбудителей ин­фекционных болезней обеспечивает не только иммунная систе­ма, но и механизмы неспецифического порядка: непроницае­мость слизистых и кожных покровов, фагоцитоз, бактерицид­ное действие лизоцима, а также гуморальные факторы: комплемент, пропердин и др. Все эти механизмы (факторы не­специфической резистентности) представляют собой первую линию противоинфекционной защиты, поскольку при первич­ном контакте с возбудителем иммунный ответ развивается толь­ко спустя некоторое время.

Количественное определение лизоцима в сыворотке крови. Лизоцим — гидролитический фермент, расщепляющий высокомоле­кулярные полисахариды бактерий (пептидогликан), находится в тканях, секретах, экскретах (за исключением пота и мочи), дей­ствует бактерицидно на многие бактерии. Присутствие и актив­ность лизоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lysodeicticus.

Готовят 1%-й агаровый гель (Дифко) на 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар темпе­ратурой 60...70°С вносят ацетоновый порошок биомассы М. lysodeicticus из расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты пере­мешивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В застывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм.

Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного белка. Для этого лизоцим разво­дят в 1/15 М ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5; 1; 3; 5, 10; 20; 40 и 70мг/мл. По 0,05 мл каждого разведения лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 °С и измеряют диаметр зоны лизиса М. lysodeicticus вокруг лунок.

По полученным данным строят калибровочную кривую, от­кладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса.

Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1:5, вно­сят по 0,03 мл в лунки и далее поступают, как при определении активности стандартного лизоцима. Измерив диаметр зоны ли­зиса, по калибровочной кривой вычисляют содержание лизоци­ма в исследуемой пробе.

Количественное определение комплемента в сыворотке крови. Комплемент (С) представляет собой сложную систему главным образом неактивных белков крови. Процесс их активации (по классическому пути) запускается образованием комплекса анти­ген — антитело (АГ — AT) и происходит в виде цепной реакции: комплекс АГ • АТ+С1+С4+С2+Сз+С5+С6+С7+С8+С9. В процессе активации образуется литический комплекс, который делает мембрану клетки проницаемой, внутрь клетки осмотически по­ ступает вода, в результате клетка набухает и лопается. Такое раз­рушение клеток (антигенов) под влиянием антител и комплемен­та получило название иммунного лизиса. Наиболее эффективно комплемент действует на бактериальные клетки в сочетании с лизоцимом. Кроме того, бактериальные клетки (антигены) после взаимодействия с антителами и комплементом легче поглощают­ся фагоцитами.

Количество комплемента в крови (сыворотке крови) опреде­ляют в реакции иммунного лизиса с использованием эритроци­тов барана и гемолизина в качестве антител к эритроцитам бара­на. Приготовление этих компонентов изложено в теме 17. Эрит­роциты барана, обработанные гомологичными антителами и чув­ствительные в таком состоянии к литическому действию комплемента, называют гемолитической системой. Количество комплемента измеряют в 50 % гемолитических единицах (СН50). За единицу комплемента принимают такое его количество в объеме 0,5 мл, которое за 30 мин при 37 °С обусловливает лизис 50 % эритроцитов в 0,5 мл гемолитической системы (5%-я сус­пензия эритроцитов барана в веронал-мединаловом буферном растворе с рН 7,3...7,4+ гемолизин в тройном титре).

Исследуемую сыворотку в возрастающих дозах разливают по пробиркам (например, 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,1 мл), добавляют ФСБР до 0,5;мл, вносят во все пробирки по 0,5 мл стандартизированной гемсистемы. Одновременно ставят конт­роль на резистентность эритроцитов (0,5 мл ФСБР + 0,5 мл гемсистемы). Пробирки встряхивают и выдерживают при 37°С 30 мин, охлаждают при 2...4'°С 10 мин, центрифугируют при 3000 мин-1 15...20 мин, насадочную жидкость колориметрируют и по коэффициенту экстинкции определяют процент гемо­лиза при помощи заранее построенной калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят следующим образом: к 1 мл 5%-й суспензии эритроцитов добавляют 3 мл дистиллирован­ной воды, эритроциты при этом полностью лизируются (100%-й гемолиз). Из полученного лизата путем добавления буферного раствора готовят пробы с 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90%-м гемолизом. На фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность каждой пробы (кювета шириной 1 мм, синий светофильтр), затем на оси абсцисс откладывают про­цент гемолиза, а на оси ординат — коэффициент экстинкции. СН5о вычисляют по дозе сыворотки, дающей гемолиз, наибо­лее близкий к 50 %. Для этого используют специальную фор­мулу (Крога) или, что проще, коэффициенты, рассчитанные по этой формуле (табл. 4).

Например, если исследуемая сыворотка в разведении 1 : 25 дает 30%-й лизис, то СН50 в 1 мл составит 25 • 0,844 = 21,1 ед.

 

 

Демонстрация фагоцитоза бактерий. К фагоцитирующим клеткам относят полиморфноядерные лейкоциты крови. Погло­щение микробной клетки фагоцитом может не сопровождаться гибелью микроорганизма (незавершенный фагоцитоз) или при­водить к внутриклеточному перевариванию захваченных бакте­рий (завершенный фагоцитоз).

Белой мыши внутрибрюшинно сначала вводят 2 мл стериль­ного МПБ, через два-три часа — 0,5 мл культуры эшерихий. Спу­стя 20...40 мин шприцем из брюшной полости отбирают экссу­дат, делают мазки на предметном стекле, фиксируют спирт-эфи­ром, окрашивают метиленовым синим (экспозиция 2...3 мин). При микроскопировании можно наблюдать различные стадии фагоцитоза: поглощение, деструкцию (переваривание) клеток (рис. 55).

Методы оценки активности фагоцитирующих клеток. Для оценки активности фагоцитов используют следующие показате­ли:

1) фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофильных лейкоцитов;

2) фагоцитарное число — сред­нее число микробных клеток, поглощенных одним лейкоци­том (характеризует интенсив­ность фагоцитоза).

Рис. 55. Фагоцитоз стафилококков: 1 — фагоциты; 2 — свободные стафилококки; 3 — фагоцитированные стафилококки

Определение фагоцитарного показате­ля: в чистую стерильную цент­рифужную пробирку вносят 0,2 мл 2%-го раствора цитрата на­трия, 0,1 мл крови, взятой у морской свинки или кролика, и 0,05 мл суспензии убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, Е. coli или др. (концентрация 0,5 • 109 клеток по оптическому стандарту мутности). Компоненты перемешивают и выдержива­ют при 37...38 "С 30 мин, затем центрифугируют при 2500...3000 мин-1 15...20 мин до образования прозрачного слоя плазмы, слоя эритроцитов и тонкого сероватого среднего слоя лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, делают три—пять мазков и окрашивают по методу Романовского—Гимзы. Препарат микроскопируют, подсчитыва­ют не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих.

Определение фагоцитарного числа: в маз­ках, которые были приготовлены для определения фагоцитарно­го показателя, подсчитывают 100 нейтрофильных лейкоцитов и суммарное количество захваченных ими бактериальных клеток, затем определяют фагоцитарное число. Например, 100 лейкоци­тов поглотили 500 бактериальных клеток, следовательно, фаго­цитарное число равно 500 : 100 = 5.

Определение опсоно – фагоцитарного ин­декса. Интенсивность фагоцитоза повышается благодаря ан­тителам — опсонинам, взаимодействующим с микробными клет­ками. Чтобы определить опсоно-фагоцитарный индекс, сравни­вают активность фагоцитов в нормальной и исследуемой (им­мунной) сыворотках.

Пастеровской пипеткой набирают на высоту капилляра около 2 см сначала суспензию бактериальных клеток (0,5 • 109/мл), за­тем лейкоцитов и, наконец, исследуемую сыворотку. На пред­метном стекле компоненты перемешивают при помощи пипет­ки, затем вновь набирают в капилляр, конец которого запаивают. Капилляр помещают в термостат при 37 °С на 30 мин. После ин­кубирования смесь выливают на предметное стекло, готовят ма­зок и окрашивают его метиленовым синим (1 мл насыщенного спиртового раствора на 30 мл дистиллированной воды).

Аналогичным образом готовят препарат с нормальной (конт­рольной) сывороткой. Оба препарата микроскопируют, просмат­ривают 100 нейтрофильных лейкоцитов, определяют количество фагоцитированных бактерий, рассчитывают фагоцитарное число в каждой сыворотке и затем опсоно-фагоцитарный индекс ис­следуемой сыворотки. Например, в 100 лейкоцитах нормальной сыворотки фагоцитировано 200 бактерий, следовательно, фаго­цитарное число 200: 100 = 2. В 100 лейкоцитах исследуемой им­мунной сыворотки захвачено 500 бактерий и фагоцитарное число 500 : 100 = 5.

Опсоно-фагоцитарный индекс показывает, во сколько раз процесс фагоцитоза в иммунной сыворотке интенсивнее, чем в нормальной. Его вычисляют делением фагоцитарного числа иммунной сыворотки на фагоцитарное число нормальной сыворот­ки. В приведенном примере опсоно-фагоцитарный индекс соста­вит 5,0:2,0 = 2,5.

Методы оценки иммунного статуса макроорганизма. Работа им­мунной системы, как и любой другой системы организма, может нарушаться, что неизбежно повысит восприимчивость животно­го к инфекционным заболеваниям.

Методы оценки Т-системы иммунитета (клеточный иммуни­тет). Из числа существующих методов оценки Т-иммунитета наиболее известны следующие.

Метод «спонтанных розеток» (Е—РОК). Т-Лимфоциты несут на своей поверхности рецепторы, реагирующие с мембранными структурами эритроцитов барана. После сорбции эритроцитов Т-клетки приобретают форму «розетки», что позво­ляет выявлять их в популяции лимфоцитов. Реакцию проводят в три этапа.

Выделение лимфоцитов барана: в центрифужную пробирку наливают 2 мл разделяющего раствора, состоящего из 9%-го водного раствора фиколла и визотраста-370, доведенного до плотности 1,077 г/мл (соотношение 8:2). Затем на разделяю­щий раствор осторожно наслаивают 2...4 мл крови с гепарином (100 МЕ/мл), разведенной средой Игла в соотношении 1 : 2...1:4. Смесь центрифугируют при 600g и температуре 20 °С. Лимфоциты, сконцентрированные в виде беловатого слоя над разделяющим раствором, отсасывают пастеровской пипеткой и отмывают средой Игла (при 600g— 10 мин два раза, 200g — 10 мин один раз).

Инкубация: средой Игла концентрацию лимфоцитов доводят до 3 • 106/мл. Готовят суспензию эритроцитов барана, эритроци­ты отмывают 0,15 М раствором хлорида натрия (три раза), затем из них готовят 0,5%-ю суспензию в среде Игла. Далее смешивают по 0,5 мл суспензии лимфоцитов и эритроцитов, смесь центри­фугируют при 200g 5 мин и оставляют при 4 °С на 18 ч.

Учет реакции: осторожно покачивая пробирку, ресуспендиру-ют осадок (не перемешивая), каплю суспензии вносят в счетную камеру и исследуют методом фазово-контрастной микроскопии. Просматривают не менее 200 лимфоцитов и подсчитывают те клетки, к поверхности которых прикреплено более трех эритро­цитов (рис. 56), — естественные розеткообразующие клетки (Е— РОК).

Технология выращивания животных отражается на их физио­логическом состоянии и на количестве Т- и В-клеток в частности (табл. 5).

Выявление Т-хелперов и Т-супрессоров. Т-хелперы и Т-супрессоры несут на своей поверхности специфи­ческие антигены, которые можно обнаружить при помощи мы­шиных моноклональных антител (см. тему 20) в реакции непря­мой иммунофлуоресценции (см. тему 18). Лимфоциты, связав­шие моноклональные антитела, светятся по периферии клеток, что позволяет определить их количество при микроскопическом исследовании.

Методы оценки В-системы иммунитета (гуморальный иммуни­тет).Включают в себя оценку В-лимфоцитов (общее содержа­ние в крови, анализ антигенных детерминант) и вырабатываемых ими антител.


 
 

Количественное определение иммуно­глобулинов разных классов методом радиальной иммунодиффузии (по Манчини). Количество и соотношение им­муноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Методика постановки реакции изложена согласно Ю. Н. Федорову (1981).

 

Иммунную сыворотку против антител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуе­мый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация антител везде одинакова, то в результа­те реакции антиген — антитело в зоне эквивалентности образу­ются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном (рис. 57). Диаметр кольца преципитации пря­мо пропорционален концентрации антигена в исследуемой жид­кости.

 

В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее) разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов в В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 ря­дов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведе­ния стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (IgG, IgA) или 48 ч (IgM).

Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандарт­ной сыворотки, на оси ординат — значения концентраций имму­ноглобулинов (% или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципи­тации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают кон­центрацию соответствующего иммуноглобулина.

Количество иммуноглобулинов разных классов в биологичес­ких жидкостях варьирует в широких пределах (табл. 6).

 

 

 

Все методы определения В-лимфоцитов в крови основаны на выявлении на поверхности В-лимфоцита структур, специфичес­ких только для В-клеток: рецепторы к Fc-фрагменту иммуногло­булинов, рецепторы к С3-фракции комплемента, иммуноглобу- линовые рецепторы, а также специфические В-антигены.

Метод розеткообразования (ЕАС—РОК): эрит­роциты барана обрабатывают антителами гемолизина, затем комплементом. Образуется комплекс АГ—AT—С, содержащий компонент комплемента С3. Далее смешивают лимфоциты жи­вотного и обработанные эритроциты барана. Эритроциты за счет присутствующих на их поверхности молекул С3 избирательно сорбируются на В-лимфоцитах, образуя «розетки».

Другие методы основаны на выявлении рецепторов к Fc-фрагментам иммуноглобулинов и иммуноглобулиновых детерминант на поверхности В-клеток. Рецептор к Fc-фрагменту иммуноглобулинов способен связывать агрегированный γ-глобулин, меченный флуорохромом, что можно в последующем уста­новить при помощи флуоресцентного анализа.

Используя меченные флуорохромом антиглобулиновые сыво­ротки или антисыворотки против иммуноглобулинов отдельных классов, например моноклональные антитела (см. тему 21), можно определить общее содержание В-клеток и дифференцировать клетки, несущие IgG-, IgA-, IgM-детерминанты.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Ознакомиться с фагоцитозом методом микроскопии мазков из перитонеального экссудата мышей после введения в брюш­ную полость культуры эшерихий.

2. Определить опсоно-фагоцитарный индекс иммунной сыво­ротки против Е. coli.

3. Оценить результаты титрования лизоцима в крови.

4. Ознакомиться с иммунным лизисом эритроцитов, определить содержание комплемента в сыворотке крови морской свинки.

5. Подсчитать количество Е—РОК лимфоцитов в готовых пре­паратах.

6. Оценить результаты реакции радиальной иммунодиффузии и рассчитать, используя готовую калибровочную кривую, содер­жание иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.

Контрольные вопросы

1. Из каких стадий состоит процесс фагоцитоза?

2. Что такое фагоцитарное число, фагоцитарный показатель, опсоно-фагоцитарный индекс?

3. Как определяют активность комплемента?

4. Какими методами определяют количество иммуноглобулинов разных классов в биологических жидкостях?

5. Какие методы применяют для оценки В- и Т-систем иммунитета?

 

Тема 15

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ: АГГЛЮТИНАЦИИ (РА), НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РИГА), КУМБСА (РК). ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Цель занятия. Ознакомить студентов с реакциями агглютина­ции, гемагглютинации и реакцией Кумбса, с техникой их поста­новки и учета результатов.

Оборудование и материалы. Культуры Е. coli различной серо-групповой принадлежности на МПА, О-агглютинирующие диаг­ностические эшерихиозные сыворотки, бруцеллезный роз-бенгал антиген, положительная бруцеллезная сыворотка, планшеты с результатами титрования иммунной сыворотки в РИГА, еди­ный бруцеллезный антиген, мерные пипетки.

Серологические реакции рассмотрены последовательно в пяти темах (№ 15... 19).

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Взаимодействие микробного антигена и антител носит строго специфический характер и направлено в животном организме на нейтрализацию возбудителя и его токсинов. Взаимодействие ан­тигена и антител in vitro при определенных условиях сопровожда­ют видимые феномены (агглютинация, преципитация, иммун­ный лизис), что позволяет использовать АГ—АТ-реакции, полу­чившие название серологических (лат. serum — сыворотка), в практических целях. Биофабрики выпускают антигены и иммун­ные сыворотки (антитела) известной специфической направлен­ности (диагностические). При помощи таких сывороток в серо­логических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя известный антиген, обнаружить в Организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение воз­будителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика). Кроме того, серологические реакции можно ис­пользовать для оценки интенсивности иммунного ответа после вакцинации или перенесенной инфекционной болезни.

Реакции агглютинации, непрямой гемагглютинации и Кумбса основаны на взаимодействии in vitro корпускулярных антигенов с антителами и способности образовавшихся комплексов выпадать в осадок. В качестве корпускулярных антигенов используют бак­териальные клетки или растворимые антигены, экстрагирован­ные из микроорганизмов и сорбированные на корпускулах носи­телей: эритроцитах, частицах латекса и т. д.

Антигенные детерминанты корпускулярных антигенов специ­фически взаимодействуют с гомологичными антителами (специ­фическая, невидимая фаза реакции), а затем комплексы анти­ген — антитело образуют крупные, видимые невооруженным гла­зом конгломераты, которые выпадают в осадок — агглютинат (неспецифическая, видимая фаза реакции). Антигены и антитела взаимодействуют лишь в присутствии электролита (в 0,8%-м ра­створе хлорида натрия).

Реакция агглютинации (РА). Разработано несколько, вариантов реакции агглютинации, различающихся по методическому исследованию и цели исследования.

РА на стекле. 1. Для идентификации микроорганизма на обез­жиренное предметное стекло наносят раздельно каплю извест­ной агглютинирующей диагностической сыворотки, например сальмонеллезной, и каплю физиологического раствора (конт­роль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раз­дельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2...4 мин.

Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны от­сутствовать. При специфическом соответствии культуры бакте­рий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (поло­жительный результат), в случае отсутствия феномена агглютина­ции делают заключениё о том, что исследуемая культура бакте­рии не соответствует иммунной сыворотке.

2. Обнаружение антител в исследуемой сыворотке крови рас­смотрим на примере роз-бенгал пробы, применяемой при серо­диагностике бруцеллеза. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезно­го антигена (окрашенные розовым-бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат.

Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобно­го типа относят к качественной, так как с ее помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

Пробирочная РА. 1. Обнаружение антител в сыворотке крови рассмотрим на примере РА для серологической диагностики бру­целлеза крупного рогатого скота. Схема постановки опыта приведена в таблице 7. Общий объем компонентов реакции 1 мл.

 

Одновременно по аналогичной схеме исследуют заведомо по­ложительную и отрицательную сыворотки (положительный и от­рицательный контроли).

Учет результатов начинают с контрольных пробирок — не должно быть спонтанной (неспецифической) агглютинации в 6-й пробирке (контроль антигена) и хлопьев осадка в 1-й про­бирке (контроль сыворотки). В остальных пробирках наличие и интенсивность агглютинации учитывают визуально и оценивают в крестах: 1) (++++)— полная агглютинация — хорошо выра­женный осадок и полное просветление жидкости (агглютиниро­вало 100 % антигена); 2) (+++) — неполная агглютинация с хоро­шо выраженным осадком и со слабой опалесценцией жидкости (агглютинировало 75% антигена); 3) (++) —частичная агглюти­нация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная (аг­глютинировало 50 % антигена); 4) (+) — очень небольшой оса­док, жидкость непрозрачная (агглютинировало 25 % антигена); 5) (—) — отсутствие агглютинации, осадка нет, жидкость мутная.

За положительный результат принимают агглютинацию мини­мум на два креста. Максимальное разведение исследуемой сыво­ротки крови, обеспечивающее агглютинацию минимум на два креста или более, называют титром сыворотки. Титр сыворотки отражает количественное содержание антител в крови исследуе­мого животного.

Из приведенного примера (табл. 8) видно, что антиген специ­фичен, так как отсутствует спонтанная агглютинация с физиоло­гическим раствором и нормальной (отрицательной) сывороткой, и активен — взаимодействует с заведомо положительной сыво­роткой. Следовательно, можно учитывать результаты РА с иссле­дуемой сывороткой крови. Титр исследуемой сыворотки (титр антител) в данном случае составляет 1 : 200.

Пробирочную РА используют не только для серодиагностики инфекционных болезней, но также для оценки активности диаг­ностических агглютинирующих сывороток или интенсивности поствакционального иммунологического ответа.

Количество антител может служить диагностическим критери­ем. Под диагностическим титром понимают минимальное количе­ство антител к данному антигену в исследуемой сыворотке, заве­домо превышающее количество нормальных антител к используе­мому в реакции антигену в сыворотке животного того же вида. При диагностическом титре антител и выше животное рассматри­вают как больное или переболевшее. При некоторых инфекцияхэтот подход не всегда продуктивен, и тогда исследуют «парные сыворотки», т. е. сыворотки, взятые от животного дважды с ин­тервалом три-четыре недели, причем первую пробу необходимо брать не позднее двух-трех суток после появления клинических симптомов болезни. На активный инфекционный процесс ука­зывает существенное повышение титра антител во второй пробе.

2. Для идентификации микроорганизмов используют проби­рочную РА, если из-за антигенного родства с различными вида­ми или внутривидовыми сероварами в РА на стекле микроорга­низм идентифицировать не удалось.

Например, если культура Е. coli дает в РА на стекле положитель­ный результат одновременно с иммунными сыворотками против нескольких О-серогрупп, ее испытывают как антиген с теми же сы­воротками уже в пробирочной РА и относят к той О-серогруппе, с сывороткой которой она дает максимальные титры (см. тему 29).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Данную реакцию относят к серологической реакции осадочного типа. В ней используют растворимые микробные антигены, сорбирован­ные на эритроцитах как носителях (антигенный диагностикум), или сорбированные на эритроцитах антитела известной иммунной сыворотки (антительный диагностикум). Антигенные диагности-кумы применяют для серологической диагностики, антитель­ные — для обнаружения антигенов в исследуемом материале.

Приготовление антигенных диагностикумов. Дефибринированную кровь отмывают ФСБР (рН 7,2) три раза. Для стабилизации (фиксации) эритроциты обрабатывают формальдегидом, глутаровым или акриловым альдегидом. Наиболее распространена формалинизация эритроцитов: 50%-ю суспензию эритроцитов сме­шивают с 50%-м раствором формалина в соотношении 1:1, вы­держивают, периодически встряхивая, при 37 ºС 2 ч и затем от­мывают ФСБР три раза.

Эритроциты легко сорбируют на своей поверхности полисаха­риды, а после обработки танином и белки. Танинизацию прово­дят, смешивая 2,5%-ю суспензию эритроцитов и раствор танина (1 :20 ООО) в соотношении 1:1с последующим выдерживанием при 37 °С в течение 15 мин. Затем эритроциты отмывают ФСБР (три раза) и доводят концентрацию до исходной. Для сенсибили­зации 1 мл 2,5%-й взвеси отмытых таннизированных эритроци­тов объединяют с 1 мл антигена и 4 мл ФСБР (рН 6,4) и выдер­живают при 37ºС 2 ч. После сенсибилизации эритроциты отмы­вают три раза и суспендируют в ФСБР (рН 7,2), который содер­жит 1 % нормальной кроличьей сыворотки, обеспечивающей стабильность суспензии. Следует отметить, что оптимальное ко­личество антигена для сенсибилизации эритроцитов определя­ют опытным путем в каждом случае.

Обнаружение антител в сыворотке крови. Сыворотку крови перед исследованием инактивируют в водяной бане при 56 °С 30 мин и проверяют на наличие антител к антигенам собственно эритроцитов. Для удаления антиэритроцитарных антител исследуемую сыворотку крови предварительно адсорбируют несенсибилизированными эритроцитами.

РНГА на стекле применяют для диагностики пуллороза — тифа птиц (качественная кровекапельная реакция непря­мой гемагглютинации — ККРНГА). На сухое обезжиренное стек­ло глазной пипеткой наносят антиген и свежую кровь (в соотно­шении 1:1), взятую из гребня или подкрыльцовой вены птицы, и смешивают, покачивая стекло. Реакцию считают положительной при выпадении в течение двух минут в смеси крови с антигеном хлопьев коричневого цвета. Параллельно ставят контроли с по­зитивной и негативной сыворотками.

Пробирочная РНГА рекомендована для серологи­ческой диагностики многих инфекционных болезней. Например, для диагностики сальмонеллезов используют количественную РНГА. Эритроцитарный антиген содержит О-антигены сальмо­нелл. Исследуемую сыворотку разводят физиологическим ра­створом в полистироловых планшетах в объеме 0,5 мл от разведе­ния 1: 100 до 1 : 800. Затем в каждую лунку вносят 0,25 мл диагностикума. Компоненты перемешивают покачиванием планшета и выдерживают в термостате при 37 ºС 2...2,5 ч. Результат РНГА оценивают в крестах (рис. 58): 1) (++++) —все эритроциты аг­глютинированы и в виде «зонтика» покрывают дно лунки; 2) (+++) — агглютинированы почти все эритроциты. На фоне «зонтика» сформировано малозаметное кольцо из осевших неаг-глютинированных эритроцитов; 3) (++) или (+) — «зонтик» пло­хо выражен, заметен осадок из неагглютинированных эритроци­тов в виде кольца; 4) (—) — эритроциты не склеены и осели на дно в виде узкого колечка с ровными краями либо в виде пунктата или колечка.

Параллельно ставят контроли с заведомо положительной и от­рицательной сыворотками. Реакция Кумбса (РК). Данная серологическая реакция также основана на феномене агглютинации. Предназначена для выяв­ления так называемых «неполных» антител, у которых только один активный центр, и по этой причине они могут специфически взаимодействовать с детерминантами антигена, но реакция не завершается формированием макроскопически видимых комп­лексов антиген — антитело. В частности, РК используют для се­родиагностики бруцеллеза животных. Предварительно сыворот­ки крови исследуют в обычной пробирочной РА. Исходя из ре­зультатов РА, для исследования берут пробирки с разведениями сыворотки, где нет агглютинации, но возможно произошло спе­цифическое связывание «неполных» антител с бруцеллезными антигенами. Антиген из этих пробирок отмывают от несвязавшихся (свободных) белков сыворотки крови центрифугировани­ем. К отмытому осадку корпускулярного бруцеллезного антигена добавляют 1 мл разведенной антиглобулиновой сыворотки, со­держащей антитела к иммуноглобулинам сыворотки крови жи­вотных того вида, который исследуют на бруцеллез. Пробирки со смесью выдерживают при 37 ºС 18 ч, затем при комнатной темпе­ратуре 2...4 ч.

Учет результатов: в положительном случае бруцеллезный ан­тиген будет агглютинировать, так как полные антитела антигло­булиновой сыворотки взаимодействуют с «неполными» антите­лами на поверхности бруцелл и вызывают агглютинацию корпус­кул антигена.

Оборудование для постановки серологических реакций. При массовых серологических исследованиях, определении титра сы­вороток используют оборудование, с помощью которого можно облегчить процедуру разведения сывороток, внесения компонен­тов реакции: автоматические пипетки, аппарат Флоринского, микротитратор «Такачи».

Аппарат Флоринского: благодаря групповой авто­матической пипетке (рис. 59) одновременно разводят 10 сыворо­ток крови или вносят компоненты в 10 стандартных серологи­ческих пробирок, размещенных в 100-гнездном штативе (10 х 10).

 

Микротитратор «Такачи» включает в себя поли­стироловые пластины (129 x 93 мм) с лунками, разбавители — уст­ройства для взятия и разведения сывороток в объеме 0,025 и 0,05 мл, стеклянные пипетки-капельницы для разлива предусмот­ренных условиями опыта объемов растворителя. При помощи стеклянных пипеток, на которые надета капельная насадка в виде пластмассового конуса со стальной трубочкой внутри, разливают по лункам пластины физиологический раствор либо буферный раствор в объеме 0,025 мл (одна капля) или 0,05 мл (две капли). Капли определенного объема (0,025 мл) формируются при усло­вии, что пипетку держат строго вертикально на расстоянии 1 см от пластины (рис. 60, а). Затем при помощи разбавителей берут необходимое количество сыворотки крови. Разбавитель представляет собой тонкие металлические стержни с наконечниками полусферической формы, состоящими из пластин с верти­кальными прорезями. Ось стержня выступает впереди наконеч­ника, что предохраняет его от повреждений. Обычно одновре­менно используют несколько разбавителей и держат их веерооб­разно (рис. 60, б). Головки разбавителей с сывороткой помещают в лунки первого ряда, вращая ось, перемешивают сыворотку с раствором, затем переносят разведенную сыворотку в следую­щий ряд лунок, обеспечивая при этом ее разведение в два раза и т.д. (рис. 60, в). На завершающем этапе в лунки с помощью ка­пельной пипетки вносят остальные компоненты реакции (рис. 60, г). Эти приспособления можно применять при постановке многих серологических реакций (РА, РСК, РНГА и т. д.).

 
 

Для внесения компонентов реакции в лунки планшетов все чаще используют 4-, 8- и 12-канальные автоматические пипетки с изменяющимися объемами (5...250 мкл) и пласти­ковые наконечники.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Идентифицировать культуры эшерихий и сальмонелл в РА на стекле с О-агглютинирующими сыворотками.

2. Определить титр положительной бруцеллезной сыворотки в пробирочной РА.

3. Учесть результаты титрования позитивной сыворотки в РНГА.

 

Контрольные вопросы

1.Какие типы антигенов используют в РА?

2.В чем сущность феномена агглютинации?

3.Что такое качественная и количественная РА?

4.Каким образом неизвестный микроорганизм идентифицирует в РА?

5.Как определить титр сыворотки крови в пробирочной РА?

6. Каким образом получают эритроцитарные диагностикумы для РНГА? 7. В чем сущность реакции Кумбса?

 

Тема 16

РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП): КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ (РКП), ДИФФУЗИОННОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РДП); ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Цель занятия. Ознакомить студентов с сущностью и техникой постановки реакций кольцепреципитации, диффузионной пре­ципитации, методом иммуноэлектрофореза. Рассмотреть их практическое использование.

Оборудование и материалы. Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка, стандартный сибиреязвенный антиген, стериль­ный физиологический раствор, пипетки Пастера, пробирки Уленгута, 1,5%-й агаровый гель с мертиолатом (конечное разве­дение 1:10 000), стерильные чашки Петри, камера для иммуно­электрофореза, готовые иммунофореграммы, штампы для РДП.

 







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1836. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.012 сек.) русская версия | украинская версия