СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ, ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 1 страница

Цель занятия. Ознакомить студентов с вакцинами различных типов, лечебно-профилактическими и диагностическими иммун­ными сыворотками, антигенами, аллергенами и принципами их контроля.

Оборудование и материалы. Вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2, против сальмонеллеза из штамма ТС-177, против лептоспироза, ботулизма, пастереллеза, лечебно-профилактичес­кие иммунные сыворотки против пастереллеза, рожи свиней, ди­агностические агглютинирующие и флуоресцирующие сальмонеллезные сыворотки, диагностические аллергены — бруцеллин, туберкулин, маллеин, стерильные МПА, МПБ, среда Китта—Тароцци в пробирках, агар Сабуро, стерильные пипетки Пастера, физиологический раствор, нефлуоресцирующее иммерсионное Масло, люминесцентный микроскоп, сенсибилизированные бру-целлами морские свинки с положительной реакцией ГЗТ.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Вакцины. Эти биологические препараты содержат в качестве активного начала цельные микробные клетки или их компонен­ты. Вакцины предназначены для создания искусственного актив­ного иммунитета. Различают несколько основных типов вакцин против инфекционных болезней сельскохозяйственных живот­ных.

Вакцины инактивированные корпуску­лярные содержат в качестве иммуногенного начала цельные инактивированные микробные клетки. При конструировании вакцин в их состав включают штаммы одного или нескольких сероваров в зависимости от антигенной гетерогенности конкрет­ного возбудителя. Используют штаммы бактерий без признаков диссоциации. Бактериальную массу чаще получают, культивируя вакцинные штаммы в жидких питательных средах в ферменте­рах. На следующем этапе бактериальные клетки инактивируют физическими (прогревание при 55...60°С, ультразвук, ультрафио­летовое облучение, ионизирующее излучение) или химическими методами (применяют такие средства, как формалин, глутаровый альдегид, бета-пропиолактон, кристаллвиолет, метиленовый си­ний и т.д.). К любому методу инактивации микроорганизмов предъявляют два основных требования: 1) 100%-я инактивация клеток возбудителя; 2) отсутствие существенных нарушений в антигенных и иммуногенных свойствах клетки возбудителя.

После инактивации устанавливают необходимую концентра­цию микробных клеток в 1 мл суспензии (концентрированием или, наоборот, разбавлением), корректируют рН, добавляют тот или иной адъювант, препарат расфасовывают и контролируют.

Анатоксинвакцины содержат в качестве иммуно­генного начала инактивированный формалином токсин бакте­рий. При ряде токсикоинфекций иммунитет в основном анти­токсический (ботулизм), обусловленный выработкой антител против бактериального экзотоксина. Для получения анатоксин-вакцин токсинобразующий штамм возбудителя культивируют в жидкой питательной среде в условиях, обеспечивающих макси­мальное накопление токсина в культуральной жидкости. Затем экзотоксин освобождают от бактерий, добавляют к нему форма­лин и выдерживают смесь в тепле. Под воздействием формали­на токсин переходит в нетоксическую форму (анатоксин), кото­рая сохраняет иммуногенные свойства. В качестве адъюванта в вакцинах подобного типа обычно используют гидроксид алю­миния.

Анавакцины: при производстве некоторых вакцин мик­робную массу и токсин не разделяют, и готовый препарат содер­жит инактивированные микробные клетки и анатоксин.

Химические вакцины в качестве иммуногенного начала содержат извлеченные тем или иным способом из мик­робной клетки различные химические соединения. Полученные вещества должны сохранить иммуногенные свойства, т. е. быть протективными антигенами. К преимуществу химических вак­цин относят возможность отделить иммуногенный компонент от балластных веществ клетки, что позволяет снизить реактогенность препарата. В принципе к химическим вакцинам можно от­нести и анатоксинвакцины.

Живые вакцины — искусственно ослабленные или природные авирулентные (слабовирулентные) штаммы возбудите­ля, которые утратили способность вызывать у естественно-вос­приимчивых животных болезнь, но могут в течение определенно­го промежутка времени размножаться в организме вакцинирован­ного животного, вызывая иммунный ответ. Два основных требо­вания к вакцинным штаммам: 1) отсутствие склонности к реверсии (возвращению в исходное вирулентное состояние); 2) неконтагиозность (возбудитель вакцинного штамма не должен передаваться от вакцинированного животного к невакцинированному). Желательно, чтобы вакцинный штамм нес стабильный маркер, отличающий его от эпизоотических штаммов возбудителя.

Искусственного ослабления вирулентности штамма (аттенуация) достигают многократными пассажами штамма через пита­тельные среды, организм невосприимчивых животных, воздей­ствием физических, химических факторов. Достаточно широко стали применять в качестве вакцинных штаммов ауксотрофные мутанты, не способные синтезировать некоторые жизненно важ­ные соединения, и поэтому, обеспечив иммунный ответ, доволь­но быстро погибающие в организме животного.

Генно-инженерные вакцины получают, искус­ственно вводя в клетку микроорганизма определенный ген (на­пример, контролирующий синтез определенного фактора пато­генности или другого протективного антигена), что в конечном итоге обеспечивает необходимую иммуногенность вакцинного препарата. В качестве передатчика генов (вектора) обычно ис­пользуют плазмиды или фаги.

Адъюванты (англ. adjuvant — помогающий) широко ис­пользуют при конструировании вакцин. Это вещества антигенной и неантигенной природы, различные по химическому соста­ву, которые при совместном с антигеном введении в организм вызывают неспецифическое стимулирование иммуногенеза. Из адъювантов неорганической природы наиболее часто используют гидроксид алюминия — минеральный гель; алюмокалиевые квас­цы, хорошо сорбирующие антигены.

К числу наиболее сильных адъювантов относят легкие мине­ральные масла со стабилизатором — безводным ланолином. Вак­цины с такими адъювантами называют эмульгированными (масляными).

Приготовление адъювантных вакцин состоит в добавлении к готовому микробному антигену соответствующего адъюванта в предварительно установленных оптимальных пропорциях.

Контроль вакцин. Вакцины всех типов после приго­товления проверяют в основном по трем параметрам.

Стерильность (инактивированные) или чистоту роста (живые) контролируют посевом на питательные среды.

Безвредность проверяют введением вакцины тем или иным лабораторным животным. Вакцина не должна вызывать заболе­вание и гибель животных.

Активность (иммуногенность) обычно контролируют следую­щим образом: вакцину вводят группе лабораторных животных, и через промежуток времени, достаточный для выработки актив­ного иммунитета (15...20 сут), эту группу вместе с контрольной группой непривитых животных заражают заведомо летальной до­зой возбудителя. Контрольные животные должны погибнуть, 80 % и более вакцинированных должны выжить. В некоторых случаях об иммуногенности препарата судят по косвенным пока­зателям: количеству агглютининов у привитых животных (лептоспирозная вакцина), антитоксинов в РН (вакцина против боту­лизма).

Например, сухую живую вакцину против рожи свиней ВГНКИ из штамма ВР-2 контролируют следующим образом.

Для контроля чистоты сухую (лиофилизированную) вакцину разводят стерильным физиологическим раствором в соотноше­нии 1: 10. Из суспензии бактерий готовят мазки, красят по Граму, микроскопируют. В препарате должны быть типичные мелкие грамположительные палочковидные клетки при отсутствии посто­ронних микроорганизмов. Одновременно проводят высевы на МПА, МПБ, среду Китта—Тароцци и агар Сабуро. Посевы выдер­живают при 37...38°С 10 сут, посевы на грибы — при 20...25 º С 15 сут. Рост посторонней микрофлоры в указанные сроки на всех питательных средах должен отсутствовать при наличии типичного роста на МПА и в МПБ культуры возбудителя рожи.

С целью контроля вакцины на безвредность и активность 20 белым мышам массой 17...18 г вводят подкожно 0, 2 мл препарата. Вакцину считают безвредной, если погибает не более 5 мышей. Через 14 дней всех оставшихся в живых вакцинированных и пять контрольных мышей заражают культурой вирулентного штамма возбудителя рожи свиней в заведомо летальной дозе. Вакцину признают активной, если погибают в течение трех-четырех суток контрольные и выживает не менее 75 % вакцинированных мы­шей.

Лечебно-профилактические иммунные сыворотки и иммуногло­булины. Данные биопрепараты применяют для создания пассив­ного иммунитета при профилактике или лечении. Под пассив­ной иммунизацией понимают введение готовых иммуноглобули­нов (антител) животному. Пассивный иммунитет возникает че­рез 20...24ч после инъекции и длится максимум две-три недели. Иммунные сыворотки получают путем многократного введения антигена животным-продуцентам (волам, лошадям и т.д.). Для получения каждого типа иммунных сывороток разработаны рег­ламенты приготовления соответствующего антигена, схемы им­мунизации и методы, с помощью которых контролируют количе­ство антител в сыворотке крови.

По направленности действия иммунные сыворотки подразде­ляют на антибактериальные, антитоксические, антивирусные. По достижении необходимого уровня антител у животного берут кровь обычно в объеме 1 % массы животного или осуществляют тотальное обескровливание. Полученную кровь сепарируют для получения сыворотки, которую стерилизуют фильтрованием и консервируют 0, 25...0, 5 % фенола, 0, 01...0, 03% тиомерсала или другими веществами.

Контроль сывороточных препаратов. Включает в себя проверку на стерильность, безвредность и спе­цифическую активность.

Стерильность препаратов проверяют посевом на питательные среды (МПА, МПБ, МППБ, агар Сабуро или Чапека).

Безвредность каждой серии обычно контролируют введением сыворотки морским свинкам. Специфическую активность сыво­ротки проверяют в зависимости от направленности ее действия.

Определение превентивных (защитных) свойств на естественно-восприимчивых или лабораторных животных заключается в том, что животным вводят подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно сыворотку, а через 20...24ч иммунизированным и контрольным животным вводят подтитрованную дозу гомоло­гичного вирулентного микроорганизма. Иммунизированные жи­вотные должны остаться здоровыми при гибели или характерном переболевании контрольных.

Активность антитоксических и ряда противовирусных сыво­роток определяют в реакциях нейтрализации. Количество анти­тел в сыворотках устанавливают при помощи различных сероло­гических реакций (РСК, РА, РИГА, РДП и т.д.).

Пример контроля иммунной сыворотки (против рожи свиней).

Контроль стерильности: сыворотку высевают на МПА, МПБ, МГТГТБ, агар Сабуро. Посевы выдерживают при 37 и 20 °С (Сабуро) десять дней. Среды должны остаться стерильными.

Контроль безвредности: пяти белым мышам массой 17...20 г вводят подкожно по 0, 5 мл сыворотки, двум морским свинкам массой 250...300 г — по 10 мл. Все привитые животные должны остаться живыми в течение десяти дней.

Контроль активности: пятнадцати белым мышам массой 17...20 г вводят внутрибрюшинно по 0, 01, 0, 02 и 0, 03 мл (по пять мышей на дозу) сыворотки. Через 2 ч всем привитым и пяти непривитым мы­шам вводят подкожно 0, 1...0, 2 мл суточной культуры вирулентного штамма возбудителя рожи свиней, разведенной 1: 200. Сыворотку считают активной, если в течение десяти дней все привитые живот­ные остаются живыми, а контрольные погибают (допускается ги­бель двух белых мышей, привитых в дозе 0, 01 мл).

Для концентрирования антител иммунной сыворотки, удале­ния серологически неактивных белков и соответственно повы­шения специфической активности препарата применяют мето­ды, с помощью которых выделяют глобулиновую фракцию бел­ков иммунной сыворотки. Готовые препараты иммуноглобули­нов контролируют, как и иммунные сыворотки: на стерильность, безвредность и специфическую активность.

Диагностические антитела. Принцип получения диагности­ческих иммунных сывороток такой же, как и лечебно-профилак­тических. Диагностические сыворотки должны характеризовать­ся не только высокой активностью в серологических реакциях, но и специфичностью. С помощью диагностических сывороток обнаруживают микробные антигены в тканевых материалах и идентифицируют выделенные микроорганизмы. В зависимости от целевого назначения можно говорить о видовых сыворотках (предназначенных для идентификации микроорганизмов на уровне вида), групповых (идентификация на уровне серологичес­кой группы), серовариантных (на уровне серовара). Иммунные сыворотки готовят для использования в различных серологичес­ких реакциях (РА, РП, РДП, РСК, РИГА, РН). При получении антител, меченных флуорохромом и ферментами, из иммунных сывороток предварительно выделяют и очищают иммуноглобулиновую фракцию. В целом диагностические сыворотки (анти­тельные диагностикумы) контролируют на стерильность, актив­ность и специфичность.

Пример контроля диагностической сы­воротки (люминесцирующей сальмонеллезной). Определе­ние активности (красящий титр): схема титрования сальмонел­лезной сыворотки показана в таблице 16.

Из 24-часовых агаровых гомологичных культур сальмонелл го­товят мазки (негустые), фиксируют их, затем на каждый мазок наносят различные разведения флуоресцирующей сыворотки. В дальнейшем препараты обрабатывают, как описано в теме 18.

Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Максимальное разведение сыворотки, обеспечивающее свечение гомологичных микробных клеток на три-четыре креста, считают ее красящим титром. Рабочий титр, т. е. используемый в работе, равен половине красящего. Красящий титр для групповых сыво­роток должен быть не ниже 1: 32, для комплексной —1: 16.

Контроль специфичности люминесцирующей сыворотки: аналогичным образом на предметных стеклах готовят мазки из гетерологичных сальмонелл и эшерихий (по нескольку культур). Флуоресцирующую сыворотку используют в рабочем титре. Све­чения гетерологичных микробов практически не должно быть.

Получение моноклональных антител. Обычные иммунные диагностические сыворотки, выпускаемые биофабриками, представляют собой смесь антител против раз­личных антигенных детерминант возбудителя инфекционной бо­лезни. Использование таких сывороток для идентификации воз­будителя сопряжено с получением перекрестных реакций между есроварами одного вида и даже между различными видами мик­роорганизмов за счет общих антигенных детерминант. Избежать таких нежелательных перекрестных реакций пытаются различ­ными способами. Один из методов заключается в использовании в качестве антигенов для иммунизации животных-продуцентов компонентов клеток возбудителя, несущих преимущественно специфические антигены. Часто такие вещества получают, раз­деляя антигенную смесь фильтрованием через сефадексы.

Другое традиционное направление в получении специфичес­ких реагентов — метод адсорбции иммунных сывороток, когда перекрестно реагирующие антитела удаляют, насыщая сыворот­ку клетками антигенно родственных бактерий. Клетки бактерий связывают перекрестно реагирующие антитела и потом их вместе с антителами отделяют от адсорбированной сыворотки центри­фугированием. Подобным образом получают адсорбированные агглютинирующие сыворотки для идентификации сальмонелл и некоторых других видов бактерий.

В качестве специфических антительных реагентов все чаще используют моноклональные антитела. Обычные диагностичес­кие сыворотки — поликлональные, поскольку содержат антите­ла, синтезированные разными линиями (клонами) В-лимфоцитов к различным антигенным детерминантам. Моноклональные антитела представляют собой иммуноглобулины, продуцируемые одним клоном клеток и реагирующие с определенным антиген­ным эпитопом микроорганизма.

Чтобы получить моноклональные антитела, изолируют и под­держивают линию лимфоцитов, синтезирующих антитела опре­деленной специфической направленности. Клетки-продуценты антител не способны расти in vitro. Злокачественная опухоль (миелома) синтезирует в больших количествах аномальные иммуно­глобулины и способна к неограниченному росту in vitro. Была разработана методика слияния клеток миеломы с лимфоцитами, при этом гибридная клетка (гибридома), как и опухолевая, спо­собна к неограниченному росту и одновременно синтезирует ан­титела, как лимфоидная. Задача сводится к обнаружению клона клеток, продуцирующих антитела необходимой специфической направленности. Получение моноклональных антител включает в себя несколько этапов.

Известным антигеном иммунизируют животных. Затем из се­лезенки выделяют В-лимфоциты.

Проводят слияние (гибридизацию) В-лимфоцитов и миеломных клеток. Получают смесь лимфоцитов гибридных и миеломных клеток.

Смесь клеток культивируют в среде, содержащей ГАТ (гипоксантин—аминоптерин—тимидин), что приводит к гибели лим­фоцитов и миеломных клеток, так как на указанной среде могут расти только гибридомы.

Гибридомные клетки рассевают (клонируют) таким образом, чтобы в лунке панели для микрокультивирования оказалась толь­ко одна клетка, дающая начало клону. После размножения кле­ток оценивают их способность синтезировать нужные антитела (проводят скрининг). Клонирование повторяют. В конечном итоге выбирают стабильный клон, продуцирующий антитела за­данной специфичности.

Клетки гибридом можно длительно хранить в замороженном состоянии (в жидком азоте).

Моноклональные антитела выделяют либо из культуральной жидкости (клетки гибридомы выращивают in vitro), либо из асцитической (выращивание in vivo).

Моноклональные антитела используют для диагностики ин­фекционных болезней в иммуноферментном, радиоиммунном и иммунофлуоресцентном анализах.

Диагностические антигены. Предназначены для постановки различных серологических реакций с целью серодиагностики ин­фекционных болезней животных. В зависимости от типа сероло­гической реакции антигены могут быть корпускулярными (РА, РСК), на носителях (эритроцитарные антигенные диагностикумы для РИГА), растворимые (РП, РДП). Технология приготовле­ния антигенов разнообразна, но основой для антигенов любого типа служат исходные селекционированные, без признаков дис­социации культуры микроорганизмов.

Контроль диагностических антигенов при выпуске проводят по следующим параметрам.

Контроль стерильности (см. вакцины).

Антиген для серологических реакций должен находиться в оп­ределенной оптимальной концентрации, выраженной, напри­мер, количеством микробных клеток в 1 мл.

Активность антигена определяют в той или иной серологичес­кой реакции с заведомо положительной сывороткой. Антиген должен давать четкую положительную реакцию. В некоторых случаях сначала устанавливают предельный титр антигена — раз­ведение, в котором он дает положительную реакцию с наиболь­шим разведением стандартной положительной сыворотки. Для постановки серологической реакции при диагностических иссле­дованиях используют рабочий титр антигена — двойную дозу предельного титра (единый бруцеллезный антиген).

Специфичность антигена испытывают в серологической реак­ции с заведомо отрицательной сывороткой.

Корпускулярные антигены для серологических реакций оса­дочного типа контролируют на спонтанную агглютинацию — вы­падение в осадок в отсутствие антител.

Пример контроля диагностического ан­тигена (бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с мо­локом).

Используют клетки бруцелл стандартной концентрации, окра­шенные гематоксилином.

Контроль стерильности: см. контроль вакцин.

Контроль специфичности и активности (табл. 17). Берут 10 проб свежего молока от здоровых коров. Молоко каждой пробы исследуют с разными количествами положительной бруцеллез­ной сыворотки.

Антиген признают специфичным, если во всех пробирках, в которые не добавляли положительную сыворотку, получен отри­цательный результат — молоко окрашено, заметно белое кольцо отстоявшихся сливок. Антиген признают активным, когда во всех трех пробирках каждой пробы с позитивной сывороткой или в пробирках с 0, 15 и 0, 1 мл сыворотки получен четкий положи­тельный результат — молоко белое, слой сливок синего цвета.

Диагностические аллергены. Данные биопрепараты (бруцеллин, туберкулин, маллеин) представляют собой экстракты из клеток возбудителя и содержат продукты их метаболизма. Аллер­гическая диагностика основана на выявлении гиперчувствитель­ности замедленного типа, которая развивается при ряде инфек­ционных болезней, особенно хронических. В основе этих диаг­ностических тестов лежит специфическая реакция иммунного воспаления с участием сенсибилизированных Т-лимфоцитов.

Пример контроля диагностических ал­лергенов (бруцеллина, предназначенного для диагностики бруцеллеза).

Контроль стерильности: см. контроль вакцин.

Контроль безвредности: бруцеллин в объеме 0, 5 мл вводят в область спины белым мышам массой 18...25 г. В течение десяти дней животные должны остаться живыми и без воспалительной реакции на месте инъекции.

Контроль специфичности: морским свинкам белой масти в депилированный участок боковой поверхности туловища внутрикожно вводят бруцеллин в объеме 0, 1 мл и сравнивают с эта­лонным препаратом. При учете результатов через 24 и 48 ч на месте инъекции не должно быть аллергической реакции. Кроме того, десяти здоровым овцам бруцеллин вводят под кожу нижне­го века по 0, 5 мл (пальпебрально) и внутрикожно в подхвостовую складку по 0, 2 мл. Контролем также служит эталонный аллерген. Аллерген считают специфичным, если у здоровых животных ал­лергических реакций не возникает. Кроме того, проверяют ал­лерген на антигенные свойства, для этого у овец через 10... 15 сут после введения аллергена исследуют в РА и РСК сыворотку кро­ви — антител не должно быть.

Контроль активности: 10... 15 белым морским свинкам вводят подкожно (0, 25... 1) • 10⁹ клеток штамма В. melitensis Rev-l для ал­лергической сенсибилизации. Через четыре недели в депилированный участок кожи вводят 0, 1 мл исследуемого бруцеллина и в качестве контроля эталонный аллерген. Реакцию учитывают че­рез 24 ч, измеряя диаметр эритем (отека).

Интенсивность реакции на исследуемый и эталонный аллер­гены должна быть одинаковой.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести контроль чистоты и безвредности живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2.

2. Изучить образцы инактивированных сорбированных, эмуль­гированных и живых вакцин.

3. Провести контроль активности и специфичности люминес-цирующих сальмонеллезных сывороток.

4. Учесть результаты бруцеллиновой кожно-аллергической пробы на сенсибилизированных морских свинках.

Контрольные вопросы

1.Какие различают типы вакцин?

2.Что такое адъюванты?

3.Как контролируют вакцины, лечебно-профилактические и диагностические иммунные сыворотки?

4.В чем заключается преимущество диагностических препаратов на основе мо-ноклональных антител?

 

Тема 21

ОТБОР, КОНСЕРВИРОВАНИЕ, ТРАНСПОРТИРОВКА И ХРАНЕНИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ. ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Цель занятия. Ознакомить студентов с общими правилами от­бора, консервирования, транспортировки и хранения материалов для микробиологического исследования. Рассмотреть этапы мик­робиологического исследования.

Оборудование и материалы. Кролик, иглы для взятия крови, центрифужные пробирки, центрифуги, 96%-й этанол, ватные там­поны, глицерин, физиологический раствор, лед, поваренная соль, термос, термометр, труп животного (кролик, морская свинка), кю­веты с парафином или доски для вскрытия животных, пинцеты, ножницы, склянки для патологического материала, схемы бакте­риологического исследования при диагностике болезней бактери­альной этиологии (бруцеллез, стафилококкоз и т.д.).

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Отбор материала для микробиологического исследования. Пра­вильный отбор материала и его транспортировка в значительной мере определяют успех исследований.

Материал берут с учетом клинических признаков болезни, ко­торые указывают на поражение той или иной системы, патолого-анатомической картины при вскрытии (изменения в различных органах — печени, легких, кишечнике и т. д.), а также основыва­ясь на предполагаемом диагнозе, поскольку для каждой инфек­ции характерна определенная локализация возбудителя в орга­низме.

Материал для исследования берут прижизненно или посмерт­но (от павших или убитых с диагностической целью животных). Во всех случаях желательно материал брать от животных, не под­вергавшихся лечению антибиотиками, и в максимально короткие после их гибели сроки, так как через 2...3ч после смерти нор­мальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани, что затрудняет выделение возбудителя в виде чистой культуры. Что­бы избежать контаминации посторонней микрофлорой, исследу­емый материал берут стерильно, с использованием стерильного инструмента и посуды для транспортировки.

Трупы мелких животных направляют в лабораторию цели­ком.

Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая требования асептики. Каж­дый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транспор­тируют в нативном виде или консервируют одним из способов.

Трубчатые кости очищают от мышц, сухожилий, за­ворачивают в ткань, смоченную 5%-м раствором фенола, или пе­ресыпают поваренной солью и затем заворачивают в ткань.

Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца.

Кровь рекомендуют брать при лихорадочных состояниях стерильным шприцем в количестве 15...20 мл. Кровь, а также другие жидкие материалы можно отбирать стерильной пастеров­ской пипеткой с последующим запаиванием ее кончика.

Моча: наружные половые органы обмывают, ополаскива­ют стерильным физиологическим раствором, осушают стериль­ным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, пос­ледующую в необходимом количестве набирают в стерильную посуду.

Мокрота: собирают до приема корма. Из трахеи берут при помощи стерильного трахеотубуса и стерильного ватного тампо­на на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении там­пона возникает кашель и удается получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным фи­зиологическим раствором. При взятии материала из носоглотки используют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны.

Секрет молочной железы: сосок обмывают во­дой, обрабатывают этанолом, ополаскивают стерильным физио­логическим раствором, сцеживают и удаляют первую порцию секрета, для микробиологического исследования берут последу­ющие порции молока.

Спинномозговая жидкость: обычно берут при наличии менингоэнцефалитического синдрома путем пункции.

Кишечник: если исследуют содержимое кишечника, то пересылают отдельные отрезки (сегменты) кишечника, перевя­занные на концах лигатурами. В остальных случаях интересую­щие отрезки кишечника освобождают от содержимого, промыва­ют стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или насыщенным раствором хло­рида натрия. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с ре­гионарными лимфатическими узлами.

Фекалии берут стерильными ватными или ватно-марле-выми ректальными тампонами, которые вводят на 8...10 см в прямую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирую­щие смеси. В противном случае нарушается исходное количе­ственное соотношение микробных видов и размножение некото­рых бактерий может привести к инактивации искомого возбуди­теля.

Консервирование, транспортировка и хранение материала. Ма­териал помещают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, флаконы, банки и т. д.), закупоривают.

При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с мате­риалом помещают в герметичный металлический пенал (ящик), который опечатывают.

Транспортировку и хранение материала до исследования про­водят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопут­ствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганиз­ма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) поме­щают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиоло­гического раствора или помещают в термос, содержащий: 1) снег или лед и поваренную соль (в соотношении 3: 1), температура смеси — 15...-20 º С; 2) равные части сухого льда и этанола, тем­пература смеси около —70 °С.

Для консервирования материала, содержащего энтеробактерии, используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема.

Глицериновая смесь: глицерин — 500 мл, физиоло­гический раствор — 1000 мл, рН смеси доводят до 7, 8...8, 0 добав­лением 20%-го раствора гидрофосфата калия. Смесь стерилизуют дробно, текучим паром.

Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода— 1000мл, дигидрофосфат калия —0, 45г, гидрофосфат ка­лия — 5, 34 г. Стерилизуют при 121 °С 20 мин.

Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магниевая, желчный бульон), которые должны со­ставлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервиро­вания фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2...6°С.

В сопроводительном документе указывают: название и адрес хозяйства, фамилию ветеринарного работника, направляющего материал, вид животного, от которого материал получен, харак­тер материала, на какую инфекцию необходимо исследовать. Кроме того, прилагают протокол патологоанатомического вскрытия и описание клинико-эпизоотологических данных.