СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ, ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 5 страница

Оборудование и материалы. Белые мыши с клиническими при­знаками ботулизма и столбняка, готовые фиксированные мазки из культур С. tetani, С. botulinum, биопрепараты.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Столбняк. Острое инфекционное заболевание животных и че­ловека, вызываемое токсином микроба С. tetani. Характеризуется повышенной возбудимостью и судорожными сокращениями мускулатуры тела, приводящими к асфикции, развивается в ре­зультате попадания спор возбудителя в раны. К возбудителю вос­приимчивы все виды домашних животных, особенно чувстви­тельны лошади. Болезнь может возникнуть после родовых травм, кастрации, обрезания хвостов или пуповины у новорожденных, если при этих операциях были нарушены правила асептики и ан­тисептики.

Возбудитель столбняка - С. tetani, род Clostridium.

Лабораторная диагностика столбняка основана на результатах ^бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодами световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-мор-фологическим, биохимическим и токсигенным свойствам.

Материал для исследования. Клиническая картина столбняка характерна, поэтому материал направляют для лабораторного ис­следования в сомнительных случаях. Им служит раневой экссу­дат, кусочки ткани из глубоких слоев мест поражения.

Микроскопия препаратов из исходного материала. С. tetani —
тонкая грамположительная спорообразующая палочковидная
бактерия размером (0, 3...0, 8) х (3...12) мкм. Споры терминальные, круглые, в два-три раза крупнее клетки, что придает ей
форму «барабанной палочки». Возбудитель – перитрих, капсулу
не формирует.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. С. tetani — строгий анаэроб,

температурный оптимум 37 º С, рН 7, 4...7, 9. Ис­следование проводят с целью обнаружения токсина и выделения культуры возбудителя для последующего определения ее токсигенности. Чтобы выделить чис­тую культуру, материал высева­ют на среду Китта-Тароцци, содержащую 0, 5 % глюкозы. Половину посевов (пробирки) прогревают при 80 °С в течение 1 ч.

Через 24 ч на среде Китта-Тароцци возбудитель дает ин­тенсивное помутнение среды с незначительным газообразова­нием. Через 48...72ч наступает просветление среды, а на дне пробирки образуется осадок. Для культуры характерен запах жженого рога (вследствие протеолиза белков).

Через 4...5 сут у полученной культуры определяют токсигенные свойства. При необходимости первичные посевы, содержащие ти­пичные клетки возбудителя, прогревают при 80 º С 20 мин и делают дробный посев на_глкжозо-кровяной агар в чашках Петри. На кровяном агаре С. tetani образует нежные колонии с отростками и приподнятым центром, иногда мелкие круглые колонии. Некото­рые колонии окружены зоной гемолиза (рис. 92).

Рис. 92. С. tetani:

а — чистая культура; б — колония

У чистых культур возбудителя исследуют биохимические свой­ства. С. tetani гидролизует желатину, не образует индол, лецити-назу, расщепляет до кислоты глюкозу, мальтозу, фруктозу, свер­тывает молоко, образует сероводород.

Биопроба. Метод применяют для обнаружения токсина в ис­следуемом материале, а также для подтверждения токсигенных свойств выделенной культуры возбудителя. Для обнаружения токсина исследуемый материал растирают в физиологическом растворе, экстрагируют при комнатной температуре 1 ч, фильт­руют. Фильтрат вбодят подкожно в заднюю лапку' двум-трем бе­лым мышам по 0, 5...1 мл или двум морским свинкам по З...5мл. При наличии токсина через 48...96ч у животных развивается те-таническое сокращение мышц отдельных групп, а затем всей мускулатуры. Животное погибает в позе с вытянутыми лапками и искривлением позвоночника в сторону лапки, в которую вводили материал. При наличии токсина исследования по выделению культуры возбудителя прекращают.

Ботулизм. Это остро текущий кормовой токсикоз, возникаю­щий вследствие поедания кормов, содержащих токсин возбуди­теля. Заболевание проявляется параличом мышц глотки, языка, нижней челюсти и скелетных мышц. К ботулизму восприимчивы многие виды животных, в том числе птицы, а также люди. Из ла­бораторных животных — белые мыши и морские свинки.

Возбудитель ботулизма — С. botulinum.

Лабораторная диагностика ботулизма основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии и его токсина методом биопробы, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и токсиген-ным свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют пробы корма, вызвавшего отравление; от павших животных - содержи­мое желудка, кишечника, кусочки печени, селезенки; от больных животных — кровь. Материал берут в течение двух часов после гибели животного.

Нативный материал исследуют одновременно на наличие ток­синов и возбудителя. Кровь исследуют только на токсин и быст­ро, на месте, так как токсин в крови быстро разрушается.

Микроскопия препаратов из исходного материала. В препаратах из материала, окрашенных по Граму, С. botulinum обнаруживают в форме прямой или слегка изогнутой с закругленными концами грамположительной палочки размером (0, 6...1, 4) х (4...9) мкм. Споры овальные, больше диаметра клетки, располагаются тер­минально или субтерминально, придавая клетке вид «теннисной ракетки». Возбудитель образует жгутики, не формирует капсулу.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Основное направление при лабораторной диагностике ботулизма — обнару­жение ботулинического токсина. Выделение чистой культуры с испытанием ее токсигенных свойств проводят только при отри­цательных результатах исследований на наличие токсина в мате­риале.

С. botulinum — строгий анаэроб, температурный оптимум 30...35 °С, рН 7, 2...7, 4. Чтобы выделить культуру возбудителя, исследуемый материал высевают в два флакона со средой Китта-Тароцци, один из них прогревают при 80 °С 1 ч, затем оба флакона инкубируют. Рост возбудителя характеризуется посте­пенным помутнением среды (на 2...3-й сутки), газообразовани­ем. У культуры отмечают специфический запах прогорклого масла. В культуре обнаруживают типичные для возбудителя клетки бактерий. На 5...7-е сутки инкубирования испытывают токсигенные свойства культуры (см. биопробу). Для выделения чистой культуры возбудителя первичные посевы прогревают при 80 º С 1 ч и дробно рассевают на глюкозо-кровяной агар в чашках Петри. Посевы инкубируют в анаэростате. Через 4...5 сут просматривают посевы. Колонии С. botulinum круглые, с корневидными отростками, бесцветные или сероватые с зоной бета-гемолиза (рис. 93).

У выделенных культур определяют ферментативные свойства. Возбудитель медленно разжижает желатину, пентонизирует мо­локо, ферментирует до кислоты и газа глюкозу, мальтозу, сали­цин, глицерин, адонит.

Биопроба. Метод применяют ддя обнаружения токсина в ис­следуемом материале или для определения токсигенных свойств выделенной культуры возбудителя. С. botulinum продуцирует ток­сины семи типов: А, В, С, D, Е, F, G. Все семь сероваров экзо­токсина иммунологически специфичны, что выявляют в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсина исследуемый материал (20...30 г) растирают в физиологическом растворе (в соотношении 1: 2), эк­страгируют при комнатной температуре 2 ч, фильтруют через вату и делят на две части, одну часть прогревают при 100 º С 20...30 мин. Затем нативным и прогретым фильтратом заражают внутривенно или внутрибрюшинно двух белых мышей. Морских свинок заражают подкожно по 3...5 мл. При наличии ботулини-ческого токсина животные, которым введен кипяченый фильт­рат, остаются живыми, нативный — погибают на 2...5-е сутки с характерной клиникой ботулизма: шаткая походка, учащенное дыхание, расслабление скелетной мускулатуры, западание брюшной стенки («осиная талия»).

При обнаружении в исследуемом материале токсина прово­дят его идентификацию. Для этого смешивают по 0, 2 мл раз­личных антисывороток в одной пробирке (А, В, С, D, Е), до­бавляют 1 мл экстракта, выдерживают 45 мин при 35...37 °С и вводят внутрибрюшинно двум белым мышам. Контрольным животным вводят смесь фильтрата с физиологическим раство­ром. При выживании мышей, зараженных смесью фильтрата и сыворотки, и при гибели контрольных токсин идентифициру­ют как ботулинический. Этот результат служит достаточным основанием для постановки положительного диагноза на боту­лизм. При необходимости определяют тип токсина в РН: сме­шивают по 2, 4 мл фильтрата и 0, 6 мл типовых сывороток, вы­держивают в термостате и ставят биопробу на мышах, как было описано выше.

Биопрепараты. Столбнячный анатоксин представляет собой фильтрат токсинсодержащей бульонной культуры, инактивиро­ванной формалином при 39...40°С в течение 25...30 сут. Затем к фильтрату добавляют алюмокалиевые квасцы, концентрируют удалением 80 % надосадочной жидкости и контролируют гото­вый препарат на стерильность, безвредность и активность имму­низацией морских свинок с последующим заражением 200 ДЛМ токсина.

Вакцину против ботулизма норок готовят из С. botulinum типа С. Бульонную токсинсодержащую культуру инактивируют формалином при 37 º С в течение 35 сут. В каждой серии вакци­ны количество анатоксина варьирует, что не позволяет реко­мендовать для вакцинации животных одну постоянную дозу вакцины. Поэтому в опыте вакцинации с последующим прямым заражением на мышах рассчитывают ЕД₅₀ препарата (по методу Кербера) и, исходя из полученных данных, определяют рабочую дозу вакцины.

Ботулинические диагностические антитоксические сыворотки предназначены для идентификации ботулинических токсинов в реакции нейтрализации.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Окрасить по Граму мазки из культур возбудителей столбня­ка и ботулизма, зарисовать микроскопическую картину.

2. Изучить клиническую картину столбняка и ботулизма (ла­бораторные животные).

3. Проанализировать схемы лабораторной диагностики столб­няка и ботулизма.

4. Ознакомиться с биопрепаратами.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические и культуральные признаки возбудителя столбняка?

2. Каковы особенности бактериологического исследования при столбняке?

3. Какой материал направляют в лабораторию для диагностического исследования при ботулизме?

4. Как определяют тип токсина С. botulinum?

 

Тема 28

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕКРОБАКТЕРИОЗА И КОПЫТНОЙ ГНИЛИ. БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятий. Ознакомить студентов со свойствами возбуди­телей и особенностями лабораторной диагностики некробактериоза, копытной гнили и биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Культура F. necrophorum на среде Китта-Тароцци, кровяном (сывороточном) МПА, мазки из куль­тур (патматериала) В. nodosus, биопрепараты.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Некробактериоз. Инфекционное заболевание, характеризую­щееся гнойно-некротическим поражением кожи и подлежащих тканей, слизистых оболочек и паренхиматозных органов. К некробактериозу восприимчивы все виды сельскохозяйственных животных, а также человек. Наиболее чувствителен молодняк.

Возбудитель некробактериоза — Fusobactehum necrophorum, род Fusobacterium, семейство Bacteroidaceae.

Лабораторная диагностика некробактериоза основана на ре­зультатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодами световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют трупы мелких животных целиком, от крупных животных — пораженные ткани и кусочки паренхиматозных органов с очагами некроза. Для прижизненной диагностики берут соскобы с участков пора­жения на границе здоровой и некротизированной ткани.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Возбуди­тель — грамотрицательная, полиморфная бактерия, образующая длинные нити, неподвижная, без спор и капсул. Хорошо окра­шивается фуксином Циля, синью Леффлера, а также по методу Муромцева и Романовского—Гимзы.

В мазках-отпечатках из пораженного органа возбудитель об­наруживают в виде грамотрицательных, длинных, иногда, переплетающихся, неравно­мерно окрашенных нитей (рис. 94).

Выделение и идентификация культуры возбудителя. F. necro­phorum — облигатный анаэроб и может расти на обычных для анаэробов средах (среда Кит­та-Тароцци, бульон Мартена, печеночный бульон Хоттинге-ра, мозговая среда, сывороточ­ный и глюкозо-кровяной агар), при 37...38 °С, рН 7, 4...7, 6. ИсСЛедуемыЙ материал высевают на среду Китта-Тароцци, МПА В МПБ.

На среде Китта-Тароцци возбудитель через 24...48 ч вызывает интенсивное помутнение сначала нижнего слоя, а позднее и всей среды. Газообразование очень слабое, отмечают в первые часы роста. Через 5...8 сут на­блюдают просветление бульона с выпадением порошковидного осадка. При высеве на плотные среды рост появляется через 48...72 ч в виде мелких росинок диаметром около 1 мм, через 4...5 сут колонии увеличиваются в размере, становятся хорошо заметными невооруженным глазом, окрашены в серовато-белый или зеленоватый цвет, края колоний ровные или немного зазуб­ренные. На глюкозном агаре с эритроцитами кролика некоторые штаммы образуют зону альфа- или бета-гемолиза. В столбике с сывороточным агаром на четвертые-пятые сутки вырастают че-чевицеобразные колонии с нитевидными отростками. В связи с тем что получение чистой культуры на питательных средах зат­руднительно, ее целесообразно выделять методом биопробы.

У выделенных культур изучают ферментативную активность. Возбудитель образует индол, сероводород, разлагает с образова­нием кислоты и незначительного количества газа глюкозу, саха­розу, мальтозу, слабо ферментирует лактозу, не разжижает жела­тину и свернутую сыворотку, не редуцирует нитраты.

Биопроба. Одновременно с посевами заражают кролика сус­пензией из исследуемого материала с физиологическим раство­ром, которую вводят в объеме 0, 5... 1 мл под кожу средней трети наружной поверхности уха. Для заражения можно использовать суточную бульонную культуру возбудителя в тех же объемах. На­блюдение за зараженными животными ведут в течение 10 дней.

При наличии в исследуемом материале F. necrophorum у кроли­ка через З...4дня на месте инъекции развивается некроз. Из оча­га некроза делают мазки и окрашивают одним из методов. Пробу считают положительной при обнаружении в мазках зернистоок-рашенных грамотрицательных нитей возбудителя некробактериоза.

Биопрепараты. «Нековак» — ассоциированная вакцина против некробактериоза конечностей крупного рогатого скота.

Двухкомпонентная вакцина «Нековак» с иммуностимулято­ром ГМДП (глюкозаминилмурамилпептид).

Копытная гниль. Это хроническое инфекционное заболевание овец и коз. Характеризуется воспалением кожи межкопытной щели, отслоением и гнилостным распадом роговой ткани копыт­ца вплоть до полного отхождения рогового башмака.

Возбудитель копытной гнили — Bacteroides nodosus, род Bacteroides, семейство Bacteroidaceae.

Лабораторная диагностика копытной гнили основана на ре­зультатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя световую, люминесцентную микроскопию и биологи­ческую пробу.

Материал для исследования. В лабораторию направляют мазки-отпечатки из свежеприготовленных тканей, мазки из слизи и слизь с кожи межкопытной щели, кусочки тканей с границы здо­ровых и пораженных участков, пораженные копыта от вынуж­денно убитых животных. Материал исследуют от нелеченых и не подвергавшихся обработке дезинфицирующими препаратами животных.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Возбудитель копытной гнили представляет собой грамотрицательную палочку размером (l...l, 7) х 3, 6мкм, неподвижную, без спор и капсул.

Мазки-отпечатки из нативного материала и доставленные мазки для исследования окрашивают по Граму и микроскопи-руют. В. nodosus обнаруживают в виде грамотрицательных, пря­мых или слегка изогнутых крупных палочек, иногда с утолще­ниями на одном или обоих концах. Располагаются поодиночке или парами. В мазках из нативного материала могут быть окру­жены радиально отходящими от них мелкими грамотрицательными палочками (феномен Бевериджа). Для обнаружения воз­будителя в материале используют непрямой метод иммунофлуоресценции.

Биопроба. Метод применяют при получении сомнительных ре­зультатов микроскопических исследований. В опыт берут овец из благополучных по копытной гнили хозяйств, которых для маце­рации копыт в течение 10 дней до постановки пробы содержат на влажной подстилке.

Двум овцам скарифицируют кожу межкопытных щелей (дела­ют 10....15 надрезов эпидермиса до появления лимфы) двух ко­нечностей — передних и задних и втирают в поврежденный учас­ток исследуемый материал или его суспензию на физиологичес­ком растворе. В межкопытные щели дополнительно вставляют тампоны из обезжиренной шерсти, пропитанные этой же сус­пензией. Через 4 дня в положительных случаях обнаруживают признаки болезни. Наблюдение за животными ведут в течение 15 дней. От заболевших животных берут материал, делают мазки-отпечатки для световой и люминесцентной микроскопии. При положительном результате биопробы в мазках обнаруживают возбудитель копытной гнили.

Биопрепараты. Вакцина против копытной гнили овец инактивированная, эмульгированная.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить мазки из культур F. necrophorum, окрасить по
Граму, промикроскопировать, зарисовать.

2. Изучить культуральные свойства F. necrophorum.

3. Промикроскопировать препараты, содержащие В. nodosus.

4. Ознакомиться с биопрепаратами.

Контрольные вопросы

1. Какие среды используют для культивирования возбудителя некробактериоза?

2. Каковы морфологические особенности возбудителя некробактериоза?

3. Как ставят биопробу при диагностике копытной гнили?

4. Как ставят реакцию иммунофлуоресценции при диагностике копытной гнили?

 

Тема 29

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭШЕРИХИОЗОВ (КОЛИ-ИНФЕКЦИИ). БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятия. Ознакомить студентов с методами лабораторной диагностики и биологическими свойствами возбудителей эшерихиозов.

Оборудование и материалы. Культуры Е. coli на МПА, средах Эндо, Левина, Симмонса, пластины ПБДЭ с результатами тести­рования ферментативной активности Е. coli, пробирки цветного ряда с культурой Е. coli (лактоза, глюкоза, индол, среда с мочеви­ной), наборы агглютинирующих антиадгезивных и О-коли-сывороток, биопрепараты.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Эшерихиоз (колибактериоз). Острая инфекционная болезнь. Проявляется профузным поносом, признаками тяжелой инток­сикации и обезвоживанием организма. Болеет молодняк сельскохозяйственных животных многих видов, включая птиц. Эшерихиоз может протекать в энтеритной, септической и энтеротоксемической формах.

Возбудители колибактериоза (эшерихиоза) — патогенные ва­рианты бактерии. Е. coli, род Escherichia, семейство Enterobacteriaceae.

При энтеритной форме болезни возбудитель локализуется, в кишечнике и регионарных брыжеечных лимфоузлах; при септи­ческой форме — в крови, внутренних органах и тканях; при энте-ротоксемической — в тонком отделе кишечника и брыжеечных лимфоузлах. Считают, что ведущая роль в развитии эшерихиоза принадлежит кишечным палочкам, адгезивные антигены кото­рых (К 88, К 99, F 41, 987 Р, А 20 и др.) обеспечивают прикрепле­ние бактерий к эпителиальным клеткам тонкого отдела кишеч­ника с последующим их размножением в клетках, продуцирова­нием энтеротоксинов и проникновением сначала в регионарные лимфоузлы, а затем в кровь.

Эшерихии в своем составе содержат 164 варианта О-антигена, 55 вариантов Н-антигена и 90 вариантов К-антигена.

О-Антиген (соматический) термостабильный, состоит из полисахаридно-липидно-протеинового комплекса, который опре­деляет серогрупповую принадлежность бактерий (известно свы­ше 160 серологических групп эшерихий).

К-Антиген (поверхностный) подразделяют на три вида, кото­рые обозначают латинскими буквами L, В и A. L- и В-антигены термолабильные, разрушаются при 100 º С в течение 1 ч. А-антиген (капсуальный) термостабильный, разрушается при автоклавирова-нии (121 °С) в течение двух часов, обнаружен у бактерий некото­рых серологических групп (08, 09, 0101 и др.). Поверхностные (L, В, А) антигены препятствуют агглютинации бактерий соответствующей агглютинирующей О-сывороткой, поэтому при серогрупповой типизации культур эшерихий их подвергают термической обработке: прогреванию в водяной бане или автоклавированию.

Н-Антиген (жгутиковый) термолабильный, белковой приро­ды, обнаружен у подвижных штаммов эшерихий. Сочетание О-, К- и Н-антигенов характеризует серологический вариант (серо­вар) бактерий.

Эпизоотические вспышки колибактериоза наиболее часто вы­зывают патогенные штаммы эшерихий следующих серогрупп: у телят - 08, 09, 015, 020, 026, 035, 078, 086, 0101, 0115, 0117, 0119, 0141, реже 02, 033, 041, 055, 0103, 0127, 0137; у поросят - 06, 026, 033, 0101, 0136, 0139, 0141, 0142, 0149, 0152, 0157; у ягнят - 04, 08, 09, 015, 020, 028, 035, 041, 078, 0101, 0137; у птиц -01, 02, 08, 015, 018, 026, 055, 078, 0111, 0113, 0128, 0141.

У поросят-отъемышей энтеротоксемическая форма колибак­териоза называется отечной болезнью.

Клинические признаки колибактериоза: слабость, потеря ап­петита, угнетенное состояние животных, обезвоживание орга­низма вследствие диареи. При затяжном течении наблюдают также серозно-гнойные выделения из носовых отверстий, артриты.

Отечная болезнь у поросят-отъемышей характеризуется появ­лением отеков век, носовой части головы, подчелюстной облас­ти. Нарушается координация движений, отмечают судороги, па­резы, гиперемию кожи ушей, пятачка, живота. Иногда наблюда­ют кратковременное повышение температуры тела в начале бо­лезни.

Лабораторная диагностика эшерихиоза основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры, иден­тификацию возбудителя на уровне вида и определение его при­надлежности к группе патогенных вариантов.

Материал для исследования. Для прижизненной бактериологи­ческой диагностики колибактериоза в лабораторию направляют фекалии больных животных (не менее чем от 5 животных с од­ной фермы), не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий массой 1...2 г от каждого животно­го берут из прямой кишки в стерильные пробирки с помощью прокипяченного резинового катетера.

Микроскопия мазков из исходного материала. Мазки-отпечатки окрашивают по Граму. Е. coli — палочковидная грамотрицательная бактерия размером (0, 3... 1) х (1...6) мкм со жгутиками (за ред­ким исключением), спор и капсул не образует. Микробные клет­ки располагаются одиночно, парно или в виде коротких цепочек.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Е. coli — фа­культативный анаэроб, температурный оптимум 37...38 º С, рН 7, 2...7, 4, к питательным средам нетребователен. Посевы из па­ренхиматозных органов, костного и головного мозга, брыжееч­ных лимфоузлов и тканей животных делают на среду Эндо или Левина методом отпечатков или наносят материал на поверх­ность среды пастеровской пипеткой и равномерно растирают шпателем.

Пробы фекалий (не более 0, 5 г) или соскобы со слизистой оболочки кишечника от каждого животного помещают в отдель­ную стерильную пробирку, затем разводят в 10 мл стерильного физиологического раствора, тщательно перемешивают и выдер­живают 10...15 мин при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость засевают бактериоло­гической петлей в чашки со средой Эндо или Левина для получе­ния изолированных колоний.

На второй день просматривают чашки и отбирают 10 коло­ний, выросших при посеве фекалий, и 5 колоний, выросших при посеве тканевых органов, характерных для эшерихий: круглых, с ровными краями, с гладкой выпуклой поверхностью, размером 2...4 мм, малинового цвета — на среде Эндо и темно-фиолетово­го — на среде Левина. Иногда у колоний отмечают металличес­кий блеск.

Колонии пересевают на МПА и среду Минка. При поддержа­нии на обычных средах эшерихий быстро утрачивают адгезивные факторы, при культивировании на среде Минка — сохраняют. В состав указанной среды входят буфер (рН 7, 5), соли магния, мар­ганца, хлорид железа, хлорид кальция, гидролизат лактальбумина, глюкоза, агар. При подозрении на отечную болезнь поросят дополнительно делают высев на кровяной МПА, поскольку штаммы, вызывающие эту патологию, обычно синтезируют бета-гемолизин.

На МПА Е. coli образует круглые, выпуклые, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии (S-форма) (рис. 95), возможно появление R-форм. Из культур, выросших на МПА и среде Минка, делают мазки и окрашивают по Граму.

 

Рис. 95. E. coli:

а – чистая культура; б - колония

 

При обнаружении бактерий, типичных по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для Е. coli биохи­мические свойства не изучают, а сразу исследуют в РА на стекле с агглютинирующими антиадгезивными сыворотками, вначале с комплексной, а затем при получении положительного результата с моновалентными сыворотками. Результат реакции учитывают в течение одной минуты. Контролем служат: 1) исследуемая куль­тура + физиологический раствор; 2) культура + нормальная кро­личья сыворотка, разведенная в соотношении 1: 10.

Культуры, выросшие на МПА, проверяют с сыворотками К 88, 987 Р и А 20, культуры со среды Минка —с сыворотками К 99 и F41. При положительной РА культуры относят к возбудителям эшерихиоза и на этом заканчивают их дальней­шее изучение.

При отсутствии эшерихий с адгезивными антигенами куль­туру идентифицируют на основании изучения фермента­тивных признаков. Для Е. coli характерно расщепление глю­козы и лактозы с образовани­ем кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы и неспособность утилизировать цит­раты. У культур, идентифицированных как Е. coli, устанавливают О-серогрупповую принадлежность как косвенный показатель патогенности или изучают патогенность в биопробе на белых мы­шах, цыплятах.

О-Серогруппу эшерихий устанавливают следующим образом. Культуры, выращенные на скошенном МПА при 37 °С в течение 18...20 ч, смывают физиологическим раствором, переносят в су­хие стерильные пробирки, прогревают в водяной бане при 100 º С 1 ч для разрушения поверхностных термолабильных L- и В-анти-генов или автоклавируют при 120 º С 2 ч для разрушения термо­стабильного А-антигена. Прогретую взвесь бактерий центрифу­гируют при 2000...3000 мин^-1 10...15 мин и осадок используют в качестве антигена для постановки РА на стекле. Оставшуюся часть антигена разводят стерильным физиологическим раство­ром до концентрации клеток 5*10³/мл и ставят пробирочную РА.

Определение серогрупповой принадлежности культур начина­ют с постановки РА на стекле с групповыми поливалентными сыворотками: на чистое обезжиренное стекло наносят по капле поливалентные сыворотки. В каждую каплю петлей вносят осаж­денную центрифугированием культуру, и хорошо смешивают, ре­зультат учитывают в течение 3 мин. Положительная реакция ха­рактеризуется образованием мелкозернистого агглютината и просветлением жидкости. При отрицательном результате вся капля остается мутной.

Антиген, агглютинирующийся одной из поливалентных груп­повых сывороток, исследуют в РА на стекле с моновалентными сыворотками, разведенными в соотношении 1: 10 и входящими в состав данной поливалентной сыворотки. Затем с моновалент­ной сывороткой, давшей положительную реакцию, ставят РА в пробирках в объеме 1 мл. Сыворотку разводят физиологическим раствором 1: 25 до титра, указанного на этикетке: сначала гото­вят исходное разведение — к 2, 4 мл физиологического раствора добавляют 0, 1 мл сыворотки, в остальные пробирки разливают по 0, 5 мл физиологического раствора, из исходного разведения пе­реносят 0, 5 мл смеси во вторую, перемешивают, из второй — в третью и т.д., из последней пробирки удаляют 0, 5мл смеси, из первой — 1, 5 мл. Во все пробирки добавляют по 0, 5 мл антигена. Одновременно ставят контроли: 1) антиген + физиологический раствор (для исключения самоагглютинации); 2) сыворотка, раз­веденная 1: 25 без антигена (для исключения флокуляции). Все пробирки встряхивают, выдерживают в термостате при 37 °С 16... 18 ч и затем при комнатной температуре — 6...8 ч. Читают ре­акцию при помощи агглютиноскопа.

Результаты учитывают по общепринятому методу и обознача­ют в крестах (++++, +++, ++, +, —).