СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ, ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 7 страница

С целью видовой идентификации исследуют ферментативные свойства. V. pseudotuberculosis образует уреазу, расщепляет рамнозу, мелибиозу, не обладает лизин-орнитиндекарбоксилазами, не гидролизует желатин, не образует индол, не утилизирует цитрат Симмонса и не дает реакцию Фогес—Проскауера при 25 º С.

Для серовариантной идентификации выделенных культур воз­будителя применяют серологические реакции. Y. pseudo­tuberculosis подразделяют на шесть серологических групп (I...VI) по термостабильным антигенам и пять вариантов — по жгутико­вым антигенам.

Биопроба. Тканевым гомогенатом или выделенной культурой заражают подкожно или внутрибрюшинно белых мышей, морс­ких свинок, кроликов. Мыши погибают через 2...4 дня, морские свинки и кролики — через 2...35 дней в зависимости от вирулен­тности культуры. Из органов павших подопытных животных де­лают посевы на питательные среды для выделения культуры возбудителя, готовят и микроскопируют окрашенные мазки и отпечатки.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Описать характер роста Y. septis и Y. pseudotuberculosis на МПА и в МПБ.

2. Промикроскопировать мазки из культур Y. pestis и Y. pseudo­tuberculosis.

3. Ознакомиться с биопрепаратами.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные морфологические признаки чумных бактерий?

2. Какие тесты используют для дифференциации возбудителей чумы от бактерий псевдотуберкулеза?

3. В чем заключаются особенности биопробы при чуме?

4. При какой температуре можно культивировать возбудителей чумы и псевдотуберкулеза?

5. Какие животные наиболее восприимчивы к псевдотуберкулезу?

 

Тема 32

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА, ТУЛЯРЕМИИ.

БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятий. Ознакомить студентов со свойствами возбуди­телей и лабораторной диагностикой бруцеллеза и туляремии, а также биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Единый бруцеллезный антиген, антиген для кольцевой реакции с молоком, роз-бенгал антиген, позитивная бруцеллезная сыворотка, негативная сыворотка, фи­зиологический раствор, содержащий 0, 5 % фенола, серологичес­кие пробирки, штативы, мерные пипетки, красители для окраски по Граму, Козловскому (Стампу), пробы молока.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Бруцеллез. Это хроническая инфекционная болезнь, проявляю­щаяся абортами, задержанием последа, эндометритами и рас­стройством воспроизводительной функции животных. Восприимчивы многие виды сельскохозяйственных животных и человек.

Возбудитель — бактерии рода Brucella: В. melitensis (три биова­ра) — основной хозяин овцы и козы; В. abortus (девять биоваров) — основной хозяин крупный рогатый скот; В. suis (четыре биовара) — основной хозяин свиньи, а также северные олени и зайцы; В. ovis — основной хозяин овцы; В. neotomae — основной хозяин древесные крысы; В. canis — основной хозяин собаки.

Лабораторная диагностика бруцеллеза основана на результатах бактериологических и серологических исследований.

Бактериологическое исследование в ос­новном применяют при первичной постановке диагноза на бру­целлез в ранее благополучных хозяйствах.

Материал для исследования. В лабораторию направляют пробы крови (сыворотки) для серологических исследований, абортиро­ванный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей или желудок плода, кусочки печени, селезенки, пробы молока (последние порции). При убое живот­ных берут паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пора­женные суставы, у самцов — семенники. Объектом исследования могут быть молочные продукты (брынза, сыр, масло и др.), объекты внешней среды.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки из материала окрашивают по Граму и одним из специальных мето­дов (по Козловскому, Стампу и др.). Бруцеллы — грамотрицательные короткие палочковидные или кокковидные бактерии размером 0, 5... 1, 5 мкм, без жгутиков, спор не образуют, форми­руют микрокапсулу. В окрашенном препарате располагаются одиночно, реже парами, короткими цепочками.

Окраска по методу Козловского: препарат окрашивают 2%-м водным раствором сафранина 2 мин, промывают водой, докра­шивают 1%-м водным раствором малахитовой зелени 1 мин, про­мывают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы красные, остальные бактерии зеленые.

Окраска по методу Стампа: фиксированный на пламени мазок окрашивают фуксином Пфейффера 10 мин, промывают водой, обрабатывают 0, 5%-м водным раствором уксусной кислоты 30 с, затем препарат промывают водой и докрашивают 1%-м водным раствором метиленового синего 20...30 с. Микроскопическая кар­тина: бруцеллы красные, другие бактерии синие.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Бруцеллы — аэробы, микроаэрофилы, температурный оптимум 37...38 °С, рН 6, 8...7, 2. Материал засевают на специальные питательные среды: мясо-пептонный агар и бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый агар и бульон, картофельный агар, эритрит-агар, сывороточ-но-декстрозный агар и др. Печеночные среды включают в себя отвар печени. Картофельный агар готовят на отваре картофеля, глюкозу и глицерин добавляют в среды соответственно в количе­стве 1 % и 2...3 %. Эритрит-агар содержит вещество (эритрит), стимулирующее рост бруцелл. В состав сывороточно-декстрозно-го агара помимо обычной питательной основы входит 10 % сыво­ротки крови и 1 % декстрозы.

Некоторые виды бруцелл растут при повышенном содержа­нии в атмосфере оксида углерода (IV) (В. abortus, В. ovis). Так как неизвестно, каким видом бруцелл заражен исследуемый матери­ал, половину посевов инкубируют в обычной атмосфере, дру­гую — в атмосфере, содержащей 10...15% оксида углерода (IV).

Посевы культивируют в течение ЗО сут, периодически просмат­ривая. Рост бруцелл чаще появляется на 7... 10-е сутки, иногда позже.

На плотных средах возбудитель формирует мелкие, прозрач­ные, круглые, с ровными краями, гладкой поверхностью, с голу­боватым оттенком колонии (S-форма), возможно появление шероховатых колоний (R-форма) (рис. 99, 100). По мере старения колонии мутнеют и за счет пигментообразования могут темнеть. На жидких питательных средах рост бруцелл проявляется равно­мерным помутнением среды, образованием голубоватого присте­ночного кольца, позднее формируется небольшой осадок.

У выросших культур изучают морфологию и тинкториальные свойства клеток в мазках, окрашенных по методам Грама, Коз­ловского.

Культуру идентифицируют серологически в РА на стекле с по­зитивной бруцеллезной сывороткой, разведенной в соотноше­нии 1: 50. Виды В. melitensis, В. abortus, В. suis антигенно род­ственны, поэтому их клетки аг­глютинируют в стандартной бру­целлезной сыворотке. Для иден­тификации В. ovis кроликов им­мунизируют выделенной куль­турой и затем кроличью сыворотку исследуют в РДСК со стандартным овисным антиге­ном (В. ovis) — должна быть четкая положительная реакция, если это культура В. ovis.

 

Рис. 100. Бруцеллы в чистой культуре

 

 

Для определения видовой принадлежности у выделенных культур бруцелл изучают потребность в оксиде углерода (IV), об­разование сероводорода, способность к росту на питательных средах с тионином и фуксином, чувствительность к бруцеллез­ным бактериофагам, ферментацию аминокислот, углеводов, а также агглютинабильность с моноспецифическими сыворотками против отдельных клеточных антигенов бруцелл (А, М, R). Неко­торые из дифференцирующих характеристик приведены в табли­це 30.

Биопроба. Это эффективный метод обнаружения бруцелл в исследуемом материале, особенно загрязненном. Морских сви­нок перед заражением исследуют в РА, в опыт берут животных, в сыворотке которых не обнаружены антитела к возбудителю. Тканевый материал в виде суспензии (1: 10) в объеме 1 мл вво­дят подкожно. О результате биопробы судят по данным иссле­дования сыворотки крови на 15, 25 и 40-й день после заражения (животные не погибают). Появление антител в титре 1: 10 и бо­лее оценивают как положительный результат. Реагирующих жи­вотных убивают и подвергают бактериологическому исследова­нию.

Серологическая диагностика: при массовых диагностических исследованиях ставят пробирочную РА, роз-бенгал пробу (РА на стекле), РСК, РДСК, кольцевую реакцию с молоком (КР).

Пробирочная РА. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разводят физиологическим раствором, содержащим 0, 5 % фенола; сыворотки крови овец коз, буйволов разводят 5%-м, а сыворотки оленей — 10%-м фенолизированным физиологичес­ким раствором. Сыворотки крови крупного рогатого скота, ло­шадей, верблюдов исследуют в разведениях от 1: 50 до 1: 400; овец, коз, свиней, буйволов, оленей, собак — в разведениях 1: 25 и более; пушных зверей — 1: 10 и более. При массовых исследо­ваниях сыворотки крови исследуют в двух первых разведениях. После приготовления разведений сыворотки в объеме 0, 5 мл в каждую пробу добавляют 0, 5 мл разведенного до концентрации клеток 5*10⁸/мл единого бруцеллезного антигена (при этом раз­ведения удваиваются), компоненты перемешивают встряхивани­ем, штатив с пробирками помещают в термостат при 37...38 º С на 18...20 ч, затем оставляют на несколько часов при комнатной температуре. Результат учитывают по общепринятой системе (см. тему 15). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки.

РА при бруцеллезе крупного рогатого скота, лошадей и верб­людов считают положительной, если титр составляет 1: 100 и бо­лее (1: 50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буй­волов и собак — 1: 50 (1: 25 — сомнительный результат). При по­лучении сомнительных реакций сыворотки крови от этих живот­ных исследуют повторно через три-четыре неделим. В ходе массовых серологических исследований практикуют исследова­ние сывороток в двух первых разведениях. При этом необходимо учитывать, что некоторые сыворотки, не агглютинирующие ан­тиген в малых разведениях, в более высоких разведениях дают положительный результат — этот так называемый феномен «про-зоны», который может служить причиной ложных отрицатель­ных результатов.

В разных странах для пробирочной РА готовят антигены, раз­личающиеся по агглютинабильности, что делает несопоставимы­ми титры, полученные при исследованиях. Поэтому рекомендо­вано выражать результат пробирочной РА в международных еди­ницах (ME). Для этого предложена международная стандартная бруцеллезная сыворотка, по отношению к которой и определяют активность национальных антигенов. Активность этой сыворот­ки установлена в 1000 ME. Например, с каким-то национальным антигеном международная сыворотка в пробирочной РА показы­вает титр 1: 500, значит, если с этим антигеном какая-либо дру­гая сыворотка дает титр РА 1: 500, то она содержит 1000 МЕ, если вторая исследуемая сыворотка показывает титр 1: 400, то ее активность в международных единицах составит 1000 • 400/500 = 800 ME и т.д. В каждой стране разработана национальная бруцеллезная стандартная сыворотка, соответствующая по ак­тивности международной. По указанным критериям положи­тельные титры РА на бруцеллез для крупного рогатого скота составляют 100 ME (50 ME — сомнительный результат), для овец, коз, буйволов, оленей и собак — 50 ME (25 ME — сомни­тельный результат).

Роз-бенгал проба (РБП). В отличие от пробирочной РА данная серологическая реакция является качественной. С ее помощью в сжатые сроки исследуют большое количество животных. Сыво­ротки, давшие положительную РБП, дополнительно исследуют в пробирочной РА и РСК. Техника постановки РБП изложена в теме 15. В РБП исследуют неразведенную сыворотку крови, влия­ние нормальных антител на специфичность реакции нивелируется использованием антигена с кислыми значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностью не реагируют с антиге­ном, что обеспечивает достаточно высокую специфичность РБП.

РСК. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Предварительно инакти-вированные в течение 30 мин сыворотки крови (лошадей при 56...58 °С, крупного рогатого скота при 60...62 °С, свиней при 60...62°С, овец и коз при 58...60°С) исследуют в разведении 1: 5...1: 10. Положительным результатом РСК (РДСК) считают задержку гемолиза на два креста и более в разведении сыворотки крови 1: 5.

Кольцевая реакция с молоком (КР). Метод применяют для ори­ентировочной проверки благополучных по бруцеллезу молочных стад и для контроля молока на рынке.

В бактериологическую пробирку наливают 2 мл исследуемого молока, добавляют 0, 1мл антигена — клетки бруцелл, окрашен­ные гематоксилином. Пробирки встряхивают и помещают в во­дяную баню при 37...38 º С на 45...50 мин, после чего учитывают результат. Положительный результат — верхняя часть столбика молока (сливки) синего цвета, остальное молоко белое или слег­ка синеватое. Отрицательный результат — слой сливок белый, молоко равномерно окрашено в синий цвет. Сомнительный ре­зультат — сливки слабо окрашены в синий цвет, молоко синего цвета.

Аллергическая диагностика не принадлежит к лабораторным методам; ее применяют непосредственно в хозяйствах. При бру­целлезе развивается состояние гиперчувствительности замедлен­ного типа (ГЗТ), которое может сопровождаться синтезом анти­тел, улавливаемых в серологических реакциях, но иногда ГЗТ от­мечают при отрицательных показаниях серологических тестов. Для обнаружения ГЗТ у животных используют диагностический аллерген — бруцеллин (см. тему 20).

Биопрепараты. Вакцина из штамма В. abortus № 19. Это наи­более изученная вакцина. Вакцинный штамм выращивают на плотных питательных средах. Устанавливают концентрацию микробных клеток 8 • 10¹⁰/мл, лиофильно высушивают. Готовый препарат контролируют на чистоту роста, диссоциацию, безвред­ность на морских свинках и белых мышах, одновременно у морс­ких свинок проверяют наличие серологического ответа на введе­ние вакцины. Иммуногенность препарата контролируют на мор­ских свинках.

Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютино-генного штамма № 82 отличается от вакцины из штамма № 19 слабым серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологичес­ких реакций дифференцировать вакцинированных животных.

Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК полу­чают следующим образом: культуру вакцинного штамма № 19 выращивают на плотной питательной среде, бактериальную массу инактивируют, проверяют на чистоту и стерильность пу­тем микроскопии и высевом на питательные среды. Контроли­руют на специфичность с физиологическим раствором и нега­тивной сывороткой. Активность проверяют в РА и РСК с на­циональной стандартной бруцеллезной агглютинирующей сы­вороткой.

Антиген для кольцевой реакции с молоком. Микробную массу культуры В. abortus (штамм № 19) готовят, как для единого бру­целлезного антигена, инактивируют, устанавливают необходи­мую концентрацию микробных клеток, протравливают сульфа­том железа, окрашивают в синий цвет гематоксилином, контро­лируют на стерильность, специфичность и активность (см. тему 20).

Роз-бенгал антиген представляет собой суспензию бруцелл в буферном растворе (рН 3, 6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розо­вый цвет. Антиген контролируют на стерильность, чистоту, рН. Специфичность проверяют с физиологическим раствором и не­гативными сыворотками, активность — методом титрования с национальной стандартной сывороткой.

Флуоресцирующую бруцеллезную сыворотку готовят из пози­тивной бруцеллезной сыворотки, глобулины которой метят флуоресцеинизотиоцианатом.

Позитивную бруцеллезную сыворотку получают гиперимму­низацией животных-продуцентов. Используют для контроля при постановке серологических реакций (РА, РСК и др.), а также серологической идентификации бруцелл.

Диагностический аллерген-бруцеллин представляет собой стерильную, прозрачную, желтоватого цвета жидкость, содержа­щую продукты жизнедеятельности бруцелл и вещества, извлеченные из них. Бактериальную массу выращивают (штамм В. abortus В-1) на агаровой среде, прогревают при 105... 110 °С 1ч, центрифугируют, надосадочную жидкость стерилизуют фильтро­ванием, бактериальную массу ресуспендируют в физиологическом растворе. Процедуру нагревания, центрифугирования и стерили­зации повторяют, после чего оба фильтрата объединяют. Полученный препарат контролируют, как описано ранее (см. тему 20).

Туляремия. Острая инфекционная болезнь. У сельскохозяй­ственных животных обычно протекает в септической форме. Ха­рактеризуется увеличением лимфатических узлов, симптомами поражения нервной системы, у крупного рогатого скота может проявляться маститами, у лошадей — абортами. Из сельскохо­зяйственных животных к возбудителю туляремии наиболее чув­ствительны поросята, ягнята, из диких животных — грызуны. Восприимчив человек.

Возбудитель туляремии — бактерия Francisella tularensis (при­надлежит к роду Francisella). Подразделяют на два биовара: F. tularensis sb. tularensis и F. tularensis sb. palaearctica. Для вида F. novicida характерна незначительная вирулентность.

Лабораторная диагностика туляремии основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры мето­дом биопробы и посевом на питательные среды; идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментатив­ным, серологическим свойствам.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют мочу, фекалии, абортированный плод; для посмертной — печень, почки, селезенку, увеличенные лим­фатические узлы; трупы мелких животных, грызунов — целиком. При необходимости материал консервируют глицерином.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки-отпе­чатки окрашивают по Граму и Романовскому—Гимзе. F. tularensis -— мелкая [(0, 3...0, 7) х (0, 2...0, 4) мкм] грамотрицательная палочковидная бактерия, преимущественно в форме кокко-бактерии. Красители воспринимает плохо, без жгутиков, спор не образует, но формирует капсулу (рис. 101). Из-за мелких размеров возбудителя его микроскопическое обнаружение затруднительно.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель
туляремии — строгий аэроб, не растет на общепринятых средах,
температурный оптимум Зб...37°С, рН 6, 7...7, 4. Исследуемый материал высевают на среду Френсиса, кровяную среду Емельяновой или желточную Мак-Коя (см. тему 7).

Среда Френсиса: к МПА (рН 7, 3) добавляют 0, 1 % цистина, 1 % глюкозы, кипятят несколько минут, охлаждают до 50 º С, до­бавляют 10 % дефибринированной стерильной крови кролика.

Среда Емельяновой: в рыбно-дрожжевой агар вносят 0, 1 % цистина, 1 % глюкозы, агар охлаждают до 45 °С и добавляют 10 % стерильной дефибринированной крови.

Посевы культивируют 24...48 ч. Возбудитель формирует мел­кие, круглые, выпуклые, с ров­ными краями, гладкой блестя­щей поверхностью, беловатые колонии (рис. 102). Из подо­зрительных колоний готовят мазки, окрашивают, микроско-пируют. В препаратах из куль­туры в отличие от препаратов из нативного материала клетки возбудителя в основном не кокковидной, а палочковидной формы.

 

Рис. 102. Колонии F. tularensis (х7)

 

У культур с типичными для F. tularensis культурально-морфо-логическими признаками исследуют ферментативные свойства (табл. 31).

 

Выделенную культуру дополнительно идентифицируют с ту-ляремийной иммунной сывороткой в серологических реакциях (РА, ИФА, РП, РИГА).

Биопроба. Выделить культуру F. tularensis посевом на питатель­ные среды удается не всегда. Более эффективен метод заражения белых мышей или морских свинок тканевой суспензией подкож­но или внутрибрюшинно по 0, 5 мл. Практикуют проведение 2...3 «слепых» пассажей на чувствительных лабораторных животных. Зараженные животные погибают на 3...5-е сутки, иногда позднее (8... 12-е сутки). У павших животных обнаруживают в паренхима­тозных органах некротические очажки. Из органов путем посева на питательные среды выделяют культуру возбудителя.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить и окрасить по методу Грама (Козловского) мазки из инактивированных клеток бруцелл, F. tularensis. Опи­сать культуральные и морфологические свойства возбудителей.

2. Исследовать в пробирочной РА и роз-бенгал-тесте сыворот­ки крови от здоровых и больных бруцеллезом животных (круп­ный рогатый скот).

3. Освоить технику постановки и учета результатов кольцевой реакции с молоком.

4. Ознакомиться с биопрепаратами для специфической про­филактики и диагностики бруцеллеза.

Контрольные вопросы

1. Какой материал направляют в лабораторию для бактериологического иссле­дования на бруцеллез и туляремию?

2. В чем состоит бактериологическое исследование на бруцеллез и туляремию?

3. Как ставят биопробу на бруцеллез и туляремию?

4. Какие методы применяют для серологической диагностики бруцеллеза?

5. Какие выпускают вакцины против бруцеллеза?

 

 

Тема 33

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАСТЕРЕЛЛЕЗА, ГЕМОФИЛЕЗНОГО ПОЛИСЕРОЗИТА И АКТИНОБАЦИЛЛЕЗНОЙ ПНЕВМОНИИ СВИНЕЙ. БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятий. Ознакомить студентов с лабораторной диагнос­тикой пастереллеза, гемофилезного полисерозита и актинобациллезной пневмонии свиней, основными свойствами возбуди­телей, биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Культуры P. multocida в МПБ, на МПА, демонстрация — штативы с тестами, характеризующими видовые ферментативные признаки P. multocida (включая биовары), культуры A. pleuropneumoniae и Н. parasuis на кровяном МПА в чашках Петри с феноменом сателлитного роста, трупы мышей, павших после заражения P. multocida, пипетки Пастера, красите­ли для окраски по Граму, Гинсу, демонстрация — чашки Петри с феноменом подавления роста культуры P. multocida серовара А в присутствии S. aureus, пробирки с отрицательной и положитель­ной трипафлавиновой пробой с культурами P. multocida сероваров А и D, МПА и МПБ в пробирках.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЙ

Пастереллез (геморрагическая септицемия). Инфекционная бо­лезнь многих видов млекопитающих и птиц. При остром течении характеризуется септицемией, при подостром и хроническом — в основном поражением легких.

Возбудитель — Pasteurella multocida (включает в себя три под­вида), род Pasteurella, семейство Pasteurellaceae.

Лабораторная диагностика пастереллеза основана на результа­тах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры посе­вом на культуральные среды и методом биопробы, идентифика­цию возбудителя по культурально-морфологическим, фермента­тивным, серологическим и патогенным свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют селе­зенку, печень, почку, кровь сердца, лимфатические узлы, пора­женные участки легких и регионарные лимфатические узлы. При необходимости материал консервируют 30%-м водным раство­ром глицерина, трубчатую кость заворачивают в марлю, пропи­танную 5... 10%-м раствором формалина.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки-отпе­чатки окрашивают по Граму и одним из методов для выявления капсулы. Пастереллы представляют собой грамотрицательные короткие палочковидные бактерии размером (0, 3...2) х (0, 2...0, 3) мкм, без спор и жгутиков, образуют капсулу.

Возбудитель в препарате из материала обнаруживают в форме мелких (0, 3x1, 5 мкм) грамотрицательных коротких палочковид­ных капсулообразующих бактерий с закругленными концами вплоть до коккобактерий. При окраске синькой Леффлера бакте­риальные клетки более интенсивно окрашены в концевых частях (биполярная окраска). Клетки располагаются единично, попар­но, короткими цепочками (рис. 103).

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель — факультативный анаэроб, температурный оптимум 37 °С (диапазон 25...40 °С), штаммы птиц растут при 42 º С, рН 7, 2...7, 4. Материал засевают на МПА, в МПБ, лучше — на кровяной или сывороточный МПА, так как нередко возбудитель в первичных посевах плохо растет или не растет на простых питательных сре­дах. Посевы инкубируют в течение 24...48 ч, при отсутствии рос­та—в течение 4...5 сут.

На плотных питательных средах пастереллы формируют мел­кие, пучке света колонии (S-форма) диаметром 1...3мм (рис. 104); возможно появление крупных, слизистых (М-форма) или шероховатых (R-форма) колоний. Культуры серовара А обра­зуют крупные (диаметр более 3 мм) слизистые колонии. Гемоли­тическая активность у P. multocida не выражена. В МПБ возбуди­тель растет с равномерным помутнением среды и образованием на дне пробирки слизистого осадка, поднимающегося при встря­хивании в виде «косички», рост мукоидных штаммов сопровож­дается более интенсивным помутнением среды. У выделенных культур исследуют морфологию и тинкториальные свойства.

У культур с типичными культурально-морфологическими признаками исследуют ферментативные свойства. P. multocida расщепляет маннит, ксилозу, не разлагает мальтозу, образует ин­дол, орнитиндекарбоксилазу, не синтезирует уреазу, не проявля­ет зависимости от V-ростового фактора ДПН (дифосфопиридин-нуклеотид). Внутри вида P. multocida дифференцируют по фер­ментативным особенностям на три подвида: P. multocida subsp. multocida ферментирует сорбит и не разлагает дульцит; P. multocida subsp. septica не ферментирует сорбит и дульцит; P. multocida subsp. gallicida ферментирует сорбит и дульцит.

Серологические свойства изучают для дифференциации куль­тур P. multocida по серовариантной принадлежности. Известны четыре серовара P. multocida (А, В, D, Е). В Европе эпизоотологическое значение имеют три серовара: В, D, А. Их идентифици­руют в РНГА по капсульным антигенам, но чаще по присущим сероварам D и А особенностям химического состава клеток. Для этого устанавливают присутствие гиалуроновой кислоты в капсульном веществе и склонность бактерий агглютинировать в ра­створе трипафлавина.

Трипафлавиновая проба: исследуемую культуру выращивают в бульоне Хоттингера (3 мл) в течение 24 ч, центрифугируют, затем удаляют 2, 5 мл культуральной жидкости, седимент ресуспенди-руют и добавляют 0, 5 мл водного раствора трипафлавина (1: 1000). Суспензию бактерий выдерживают при комнатной температуре 10...20 мин. Учет результатов: если суспензия стабильна, культуру относят к сероварам А или В; если сформирован осадок, культу­ру относят к серовару D.

Тест на гиалуроновую кислоту в составе капсулы: исследуе­мую культуру засевают «штрихом» на агар Хоттингера в чашках Петри, затем высевают в виде прямой линии по диаметру чашки культуру S. aureus, способную продуцировать гиалуронидазу. По­севы инкубируют 18...24 ч, после чего просматривают колонии в косопроходящем свете. Культуральные свойства P. multocida се-роваров В, D, Е вблизи «штриха» S. aureus не изменяются, коло­нии культур серовара А (из-за расщепления гиалуронидазой ста­филококка гиалуроновой кислоты в составе капсулы пастерелл) тусклые, серые или голубые, а не флуоресцирующие.

Биопроба. Метод используют для выделения культуры возбу­дителя из исследуемого материала и определения вирулентности чистых культур.

Исследуемым материалом от крупного рогатого скота, свиней, овец заражают белых мышей и кроликов; материалом, получен­ным от птиц, заражают голубей, кур, уток. Кроликов перед био­пробой исследуют на пастереллоносительство: в течение трех дней вводят интраназально по две капли 0, 5%-го водного раство­ра бриллиантового зеленого. Появление гнойного истечения из носовой полости указывает на пастереллоносительство, и таких животных из опыта исключают.

Суспензию тканевого материала, разведенную физиологичес­ким раствором (1: 10), вводят кроликам подкожно по 0, 5 мл, бе­лым мышам подкожно по 0, 2 мл, голубям внутримышечно по 0, 3 мл. При наличии в материале возбудителя животные погиба­ют через 18...36 ч. Трупы животных подвергают бактериологичес­кому исследованию.

Биопрепараты. Вакцина эмульгированная против пастереллеза крупного рогатого скота представляет собой инактивированные 0, 25%-м раствором формальдегида клетки пастерелл серовара В в водно-масляной эмульсии. Контролируют на стерильность, без­вредность (белые мыши, кролики) и иммуногенность на кроли­ках. Кроме того, готовят эмульгированные вакцины против пас­тереллеза свиней, кроликов, нутрий.