МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ
Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации - теряют некоторые нативные (природные) свойства, например, растворимость, биологическую активность. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы. Процесс начинают с гомогенизации биологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы». Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей. Для фракционирования и очистки белков используют следующие методы. Высаливание – осаждение белков из раствора при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. Этот метод используется в клинической практике при анализе белков сыворотки крови, например, для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении). Электрофорез основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови. Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы. Хроматография (от греч. chroma – цвет) - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент). Различают следующие разновидности хроматографии: - адсорбционная - разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте; - распределительная - твердая фаза служит опорой для стационарной жидкой фазы. Разновидностью является хроматография на бумаге; - ионообменная - используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки; - гель-хроматография, или метод молекулярных сит, основан на способности небольших молекул проникать в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки. Позволяет разделить белки с разной молекулярной массой. Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и г азовая хроматография. Хроматография является одним из основных методов биохимических исследований. В клинических лабораториях ее применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.
|
