Студопедия — Генно –инженерные методы анализа ДНК.
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Генно –инженерные методы анализа ДНК.






 

Генно-инженерные методы опираются на достижения в исследованиях ферментативных систем метаболизма нуклеиновых кислот и существуют благодаря возможности получения таких ферментов в высокоочищенном состоянии.

Генно-инженерные работы, как правило, начинаются с получения препаратов высокоочищенных нуклеиновых кислот. При очистке ДНК и РНК в основном используют одни и те же приемы. Все современные методы выделения нуклеиновых кислот состоят из 3-х этапов: разрушения клеток, инактивации нуклеаз и собственно очистки.

Для разрушения клеток их помещают в специально приготовленный буферный раствор, в который добавлены протеиназы (для очистки от белков) и вещества, инактивирующие нуклеазы (например, ионные детергенты, фенол, хлороформ или др.), чтобы они не успели гидролизовать молекулы нуклеиновых кислот. Поскольку при освобождении от белков происходит одновременная очистка ДНК и РНК, для отделения примесей РНК используют высокоочищенные препараты РНКаз без примесей ДНКаз (чаще всего панкреатическую РНКазу), а в случае выделения РНК - препараты ДНКаз, не загрязненных РНКазами.

При использовании большинства методов выделения ДНК из тканей животных происходит одновременное выделение геномной и митохондриальной ДНК. В случае необходимости, для освобождения от митохондриальной ДНК на первых стадиях очистки геномной ДНК получают ядра клеток анализируемых тканей. Альтернативно, при необходимости выделения чистой митохондриальной ДНК вначале получают эти органеллы.

Для определения размеров и выделения небольших фрагментов дцДНК (двухцепочечных ДНК), образующихся при действии эндонуклеаз рестрикции или во время секвенирования ДНК, применяют электрофорез в агарозном, полиакриламидном или смешанном агарозно-полиакриламидном гелях. Проявление фрагментов в этом случае проводят с помощью бромистого этидия, интеркалирующего между основаниями ДНК и флуоресцирующего в ультрафиолетовом свете. Более чувствительными методами обнаружения фрагментов ДНК в гелях являются окраска солями серебра, авторадиография и введение флуоресцентной метки.

Для специфической очистки эукариотической мРНК, которая содержит на 3΄-конце поли(А)-последовательность, используется метод аффинной хроматографии на олиго(dT)-целлюлозе. Поли(А)-последовательности связываются с матриксом. После отмывки фракций РНК, не связавшихся с матриксом (тРНК, рРНК и др.), фракцию мРНК элюируют, прогревая колонку до температуры плавления поли(А)-олиго(dT)-гибридов

Перечисленные выше способы очистки и фракционирования нуклеиновых кислот позволяют получать лишь относительно короткие последовательности нуклеотидов. Однако в настоящее время в арсенале молекулярной биологии имеются методы, которые дают возможность выделять в гомогенном состоянии последовательности нуклеотидов, эквивалентные целым хромосомам. Одним из таких методов является электрофорез в импульсном электрическом поле (pulsed field gel electrophoresis - PFGE), с помощью которого удается препаративно разделять, например, ДНК целых хромосом дрожжей или простейших. В этом методе разделение ДНК осуществляется под воздействием меняющегося по направлению электрического поля. Время включения того или иного поля называется временем пульса. Переключение полей при этом должно осуществляться как можно более быстро (например, 100с).

После выделения тотальной ДНК ее фрагментируют с помощью ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью – рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз ). In vivo эти ферменты участвуют в системе распознавания и защиты «своих» и уничтожении чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 – 8, реже из 9 – 12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции, или сайтами узнавания. Последовательности ДНК, служащие сайтами рестрикции, представляют собой обращенные повторы. Одни рестриктазы разрезают цепи ДНК по оси симметрии этих повторов, в результате чего образуются фрагменты ДНК с «тупыми» концами. Другие ферменты разрезают ДНК, отступая от оси симметрии, при этом продукты рестрикции имеют выступающие одноцепочечные комплементарные, «липкие» концы. При обработке ДНК рестриктазой количество образующихся фрагментов определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции в геноме, а их размер – характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз, причем каждый из этих ферментов узнает свою, специфическую последовательность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий и обозначают тремя прописными буквами, соответствующими латинскому названию вида бактерии, и римской цифрой, соответствующей хронологии открытия этого фермента у данного вида бактерий. Например, EcoRI – из E. coli, HindIII – из Haemophilus influenzae.

Обязательным элементом анализа плазмидных, вирусных, бактериальных ДНК и относительно небольших фрагментов ДНК эукариот является физическое (рестрикционное) картированиеопределение мест локализации сайтов рестрикции для различных рестриктаз. Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, тем самым может быть определена их молекулярная масса, а значит, и физическое расстояние между сайтами. Для анализа фрагмент ДНК обрабатывают несколькими рестриктазами, затем проводят электрофоретический анализ перекрывающихся, аддитивных по длине фрагментов ДНК и на основе полученных данных упорядочивают сайты рестрикции для каждого из ферментов относительно друг друга или каких-то иных маркеров, присутствующих в исследуемой молекуле ДНК.

Следующим этапом анализа изолированного фрагмента ДНК является определение нуклеотидной последовательности, т.е. секвенирование. Методология секвенирования заключается в том, чтобы получить серию комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. Существует два основных метода секвенирования: метод Максам-Гилберта и метод Сэнджера. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором – синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют праймер (искусственно синтезированный короткий фрагмент ДНК, комплементарный определенному участку исходной молекулы ДНК), создают условия для гибридизации праймера и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и смесь дезокситрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), один из которых является радиоактивным. Синтез ведут параллельно в 4-х пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических терминаторов синтеза ДНК (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). При встраивании теминатора на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается. Таким образом, в каждой из пробирок получают множество радиоактивно меченых фрагментов ДНК, различающихся по длине. Затем методом одновременного электрофореза на 4-х соседних дорожках их разделяют, определяют размер синтезированных фрагментов, а следовательно, и локализацию дидезоксинуклеотидов. Отсюда узнают последовательность нуклеотидов в исходной молекуле ДНК. Например, если при анализе на радиоавтографе пробы, полученной путем синтеза в присутствии ввСЕЗ, выявлены фрагменты длиной 3 и 4 нуклеотида, это значит, что в анализируемом фрагменте ДНК в соответствующих позициях расположен гуанин.

На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная последовательность всего около 500 п.н. работа по определению нуклеотидных последовательностей крупных геномов, состоящих из миллионов и более нуклеотидов, сильно облегчается использованием компьютерных программ, которые позволяют быстро находить перекрывающиеся последовательности в анализируемых фрагментах и затем составить полную картину генома. Методы Максама-Гилберта и Сэнджера в настоящее время практически полностью автоматизированы. При работе методом Сэнджера в 5΄-конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из 4-х анализируемых нуклеотидов используют флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофореза гель сканируют при различных длинах волн, и полученная информация обрабатывается на компьютере. При этом все биохимические операции также проводятся роботом, и скорость секвенирования превышает 100 000 нуклеотидов в сутки.

Идентификация специфических участков в протяженных молекулах ДНК осуществляется с помощью ДНК-зондов. Зондом может служить любая однонитевая ДНК ограниченного размера, используемая для поиска комплементарных последовательностей. При добавлении такой молекулы к пулу разнообразных однонитевых ДНК и обеспечении условий для гибридизации ДНК-зонд образует двунитевую структуру только с той молекулой ДНК и только в том месте, где он найдет комплементарную последовательность. В ДНК-зонд может быть введена радиоактивная, флюоресцентная или иная метка, по которой можно следить за местоположением зонда.

В ряде случаев в качестве зондов используют искусственно синтезированные последовательности ДНК длиной не больше 30 п.н. Подобные зонды пригодны, в частности, для поиска генов, белковые продукты которых идентифицированы. Это позволяет прогнозировать нуклеотидные последовательности возможных вариантов ДНК, кодирующих известные последовательности аминокислот, производить их искусственный синтез и использовать для идентификации и молекулярного анализа соответствующих генов. Поскольку скорость гибридизации ДНК ограничивается вероятностью столкновения комплементарных последовательностей, скорость гибридизации с ДНК-зондом дает возможность определить число копий генов в ДНК. Это очень точный метод. Который позволяет выявить один-единственный ген в клетке. Так выявляют уникальные гены, а также гены, представленные в геноме десятками и сотнями копий.

Зондами могут служить также выделенные из генома последовательности ДНК. Однако предварительно такие последовательности клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в любом количестве. Процесс молекулярного клонирования, или избирательного накопления идентичных молекул ДНК, состоит из нескольких этапов: фрагментация ДНК рестриктазами, создание рекомбинантной ДНК (объединение полученных фрагментов in vitro с векторной молекулой ДНК) и введение вектора в реципиентный организм, в котором и происходит накопление рекомбинантной ДНК. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от сотен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется способностью вектора удерживать чужеродный фрагмент ДНК.

Вектор – это молекула ДНК, переносящая клонируемый фрагмент ДНК. В качестве векторов при клонировании в бактериальных клетках чаще всего используют плазмиды. Плазмида, используемая в качестве вектора, должна включать следующие элементы:

1) сайт ori (участок инициации репликации) для нормальной репликации ДНК в клетке бактерии;

2) доминантный селективный маркер (например, ген устойчивости к какому-то антибиотику), позволяющий отобрать клетку, несущую гибридную плазмиду;

3) уникальный (т.е. встречающийся в векторе единственный раз) сайт рестрикции.

Плазмидную ДНК легко изолировать из бактериальных клеток. Кольцевую молекулу ДНК переводят в линейную форму путем внесения единичного разрыва в месте локализации уникального сайта рестрикции, при этом ДНК имеет «липкие» концы. С помощью лигаз осуществляют присоединение фрагмента чужеродной ДНК к концами линейной молекулы, после чего гибридная плазмида вновь приобретает кольцевую форму. Затем производят трансформацию бактерий, т.е. искусственное введение плазмид в бактериальные клетки. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий встроенного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чужеродный для бактерий генетический материал может быть получен практически в любых количествах.

Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов используют фаги – бактериальные вирусы. Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с чужДНК с образованием химерного фага. Чисто технически эта операция проще, чем вставка в плазмиду. Однако размеры встраиваемой ДНК ограничены пакующей способностью головки фага. В последнее время большое распространение получило клонирование в космидах – конструкциях, объединяющих в себе преимущества плазмид и фагов. Космиды конструируют на основе плазмид, но в них вводят генетические элементы фага λ, отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фаговых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами и могут нести до 40-45 тыс. п.н. чужДНК.

Все вышеперечисленные векторы используются для клонирования в прокариотических системах. Векторы, пригодные для направленного переноса в эукариотические клетки, конструируют на основе дрожжевых плазмид – единственных плазмид, обнаруженных в клетках эукариотических организмов., а также используют различные эукариотические вирусы (вирусы полиомы, осповакцины, герпеса, ряда адено- и ретровирусов). Для переноса генов в растения перспективны векторы, сконструированные на основе плазмид Ti и Ri, присутствующих в штаммах агробактерий. Эти плазмиды рассматриваются как природные векторные молекулы, поскольку они могут передаваться от бактерий в клетки растений в естественных условиях. В качестве векторов растений применяют и некоторые ДНК-содержащие вирусы, в частности, вирус мозаики цветной капусты, а также ДНК хлоропластов и митохондрий.

Чаще всего идентификацию с помощью ДНК-зондов специфических участков в геномной ДНК проводят после ее рестрикции и электрофоретического разделения образовавшихся фрагментов. Эта технология, ставшая уже классической, получила название блот-гибридизации по Саузерну в честь автора метода, предложившего его в 1975 г. Суть метода заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрикции одной или несколькими рестриктазами, после чего образующиеся фрагменты разделяются по молекулярному весу в агарозном геле. Затем с геля ДНК переносится и фиксируется на плотном носителе, представляющем собой нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану, и подвергается обработке высокой температурой или ультрафиолетом. Эта процедура напоминает прикладывание промокательной бумаги к тексту с еще не высохшими чернилами (от англ. blotting – промокание). Фиксированную на фильтре и денатурированную ДНК подвергают гибридизации с радиоактивно меченым ДНК-зондом. После отмывки (для удаления несвязавшейся меченой ДНК) и высушивания на фильтр накладывают рентгеновскую пленку и проводят радиоавтографию. Места засветки пленки будут соответствовать положению искомого фрагмента геномной ДНК, содержащей комплементарные зонду последовательности. Метод используется для картирования хромосомных перестроек на физической карте, определения положения гена, выявления повторов и т.д.

Метод, похожий на Саузерн-блот, но применяющийся для анализа РНК, называется Нозерн-блот. Применяют Нозерн-блот в следующих целях:

1) для определения размера специфических мРНК, кодируемых данным геном;

2) для выяснения того, присутствуют ли в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.е. экспрессируется ген или нет;

3) для определения количества этой РНК и его изменения в развитии данного типа клеток.

Основным источником фрагментов ДНК, необходимых для конструирования ДНК-зондов или для прямого молекулярного анализа, являются искусственным образом сконструированные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск нужных последовательностей ДНК. Библиотека генов представляет собой набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих исходную молекулу ДНК, выделенную из какого-либо специфического источника. При конструировании библиотеки генов на первом этапе исходную ДНК разрезают на перекрывающиеся фрагменты, чаще всего – путем добавления специфического набора рестриктаз; затем создают условия для клонирования каждого из этих отдельных фрагментов. В результате получают набор клонов, в каждом из которых содержится чужеродный фрагмент ДНК в составе клонирующего вектора.

Первую геномную библиотеку создали Т.Маниатис с сотрудниками в 1978 г. Они использовали ДНК из генома D. melanogaster, которую клонировали в клетках E. coli.

Очень важным примером геномных библиотек являются хромосомные библиотеки генов, которые конструируют из отдельных хромосом. В результате получают набор клонированных фрагментов геномной ДНК, принадлежащих определенной хромосоме. Такие библиотеки построены для каждой хромосомы человека.

Тканеспецифические библиотекигенов строят из комплементарной ДНК (кДНК), которую получают путем обратной транскрипции из тотальной мРНК, выделенной из определенной ткани или из специфических культивируемых клеток. Поскольку библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из которых была выделена мРНК, создание и анализ таких библиотек особенно полезны для сравнения генной активности в клетках разных типов.

Для того чтобы выявить и изолировать клоны, находящиеся в библиотеках, существуют различные способы. Суть их всех состоит в скринировании библиотек. Чаще всего скрининг производят с помощью ДНК-зондов. Для этого суспензию фагов, содержащих геномные клоны, высеваются на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий. В тех участках, где фаги инфицировали бактерии и размножились, образуется литическая бляшка. Каждая бляшка состоит из большого числа потомков одиночной фаговой частицы, размножившихся в инфицированных и лизированных бактериях. Все культуры дублируют на другие чашки Петри путем отпечатка – реплики. Затем на исходную культуру накладывают мембранный фильтр, в результате чего ДНК из бляшки связывается с ним. Последующая обработка фильтра щелочным раствором приводит к денатурации ДНК на одиночные нити. После этого фильтры инкубируют с меченым зондом. После отмывки фильтров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локализации колоний, содержащих встроенные чужДНК, комплементарные зонду. По положению засвеченного пятна находят бляшку на газоне. Фаги с этой бляшки можно собрать и, инфицировав новые бактерии, размножить, а следовательно, и размножить клон до количеств, необходимых для молекулярного анализа.

До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клонирование являлись единственными способами поиска и выделения специфических последовательностей ДНК с целью их дальнейшего исследования. Это очень трудоемкие методы, которые к тому же обладают рядом недостатков (получение ДНК-зондов требует большой предварительной работы; иссследуемые фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слишком велики для прямого молекулярного анализа; для проведения блот-гибридизации необходимо большое количество хорошо очищенной не фрагментированной геномной ДНК, которая может быть получена из достаточно большой массы биологического материала).

Изобретенный в 1983 г. американским исследователем Карри Мюллисом альтернативный метод анализа геномной ДНК – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – явился эпохальным открытием молекулярной биологии ХХ века. Исходную молекулу ДНК прогревают, чтобы разрушить водородные связи между комплементарными цепями. Затем реакционную смесь охлаждают в присутствии двух искусственно синтезированных коротких фрагментов ДНК (праймеров), один из которых комплементарен участку ДНК слева от изучаемого локуса, а второй – участку другой нити справа от изучаемого локуса. Эти праймеры связываются с соответствующими участками ДНК и задают точку начала синтеза новой комплементарной нити на матрице ДНК. Осуществляет этот синтез фермент ДНК-полимераза. В следующем цикле синтеза реакционную смесь с полученными нитями ДНК вновь прогревают и вновь синтезированные нити ДНК используют в качестве матрицы. При проведении ПЦР синтезируется только небольшой фрагмент, расположенный между двумя праймерами. За 30 циклов число синтезированных фрагментов составит около 1 млрд. При этом в качестве матрицы могут быть использованы любые образцы ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. Огромное количество копий синтезируемого фрагмента ДНК и его небольшие размеры позволяют проводить прямое молекулярное исследование этого участка. Конкретные методы анализа амплифицированных фрагментов составляют основу клинической ДНК-диагностики, т.е. оценки состояния определенного участка ДНК у пациента. В частности, метод ПЦР позволяет проводить прямую диагностику мутаций в генах для сотен моногенных наследственных заболеваний. На ПЦР основаны современные методы диагностики бактериальных и вирусных инфекций, позволяющие обнаруживать присутствие инфицирующих агентов вне зависимости от их активности. ПЦР лежит в основе геномной дактилоскопии, являющейся одним из наиболее эффективных методов идентификации личности в судебной медицине и установлении родства.

 

 







Дата добавления: 2015-12-04; просмотров: 166. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МЕХАНИКА Статика является частью теоретической механики, изучающей условия, при ко­торых тело находится под действием заданной системы сил...

Теория усилителей. Схема Основная масса современных аналоговых и аналого-цифровых электронных устройств выполняется на специализированных микросхемах...

Логические цифровые микросхемы Более сложные элементы цифровой схемотехники (триггеры, мультиплексоры, декодеры и т.д.) не имеют...

Способы тактических действий при проведении специальных операций Специальные операции проводятся с применением следующих основных тактических способов действий: охрана...

Искусство подбора персонала. Как оценить человека за час Искусство подбора персонала. Как оценить человека за час...

Этапы творческого процесса в изобразительной деятельности По мнению многих авторов, возникновение творческого начала в детской художественной практике носит такой же поэтапный характер, как и процесс творчества у мастеров искусства...

Принципы и методы управления в таможенных органах Под принципами управления понимаются идеи, правила, основные положения и нормы поведения, которыми руководствуются общие, частные и организационно-технологические принципы...

ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ САМОВОСПИТАНИЕ И САМООБРАЗОВАНИЕ ПЕДАГОГА Воспитывать сегодня подрастающее поколение на со­временном уровне требований общества нельзя без по­стоянного обновления и обогащения своего профессио­нального педагогического потенциала...

Эффективность управления. Общие понятия о сущности и критериях эффективности. Эффективность управления – это экономическая категория, отражающая вклад управленческой деятельности в конечный результат работы организации...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.013 сек.) русская версия | украинская версия