ДНК-сенсоры с пероксидазой хрена в качестве метки

Разработаны биосенсоры, основанные на использовании ДНК или олигонуклеотидов в качестве биораспознающих реагентов и пероксидазы хрена в качестве метки. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. При этом зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишенью, затем последовательно добавляют авидин или стрептавидин и биотинилированный фермент, в качестве которого может быть использована пероксидаза хрена. Альтернативой может служить конъюгат пероксидазы со стрептавидином, имеющим сайт связывания с биотином. Такой подход был использован при разработке электрохимического сенсора для определения человеческого цитомегаловируса [31]. Детекцию проводили методом дифференциальной импульсной вольтамперометрии. Биосенсор имеет высокий предел обнаружения (0,6 пикоМ амплифицированного фрагмента ДНК вируса), что в 23000 раз чувствительнее, чем электрофоретическое определение в агарозном геле и в 83 раза чувствительнее колориметрического метода определения результата гибридизации в планшетах.

Разработана система электрохимических биосенсоров для определения патогенных бактерий в моче [32]. Система состоит из 16 сенсоров с золотыми электродами, на которых иммобилизованы олигонуклеотиды, специфичные для групп E.coli, P. mirabilis, Ps. aeruginosa, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Enterobacteriaceae. В качестве метки используется флуоресцеин, который выявляется конъюгатом антител к флуоресцеину с пероксидазой хрена. Для определения активности пероксидазы используется субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ), который одновременно служит как медиатор — переносчик электронов. Метод позволяет определять до 2600 уропатогенных бактерий в культуре и клинических образцах, продолжительность анализа 45 мин.

В работе [33] предложен высокочувствительный метод количественного определения ДНК и РНК как непосредственно в образцах, так и после амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). При проведении ПЦР используются меченые праймеры: в качестве метки одного праймера служит биотин, второго праймера — флуоресцеин. На поверхности электродов иммобилизовали конъюгат нейтроавидина с коллоидным золотом. Образец ДНК после ПЦР наносили на электрод, результат взаимодействия меченой ДНК с нейтроавидином выявлялся конъюгатом антител к флуоресцеину с пероксидазой. Для детекции электрохимической активности пероксидазы использовали метод прерывистой импульсной амперометрии с ТМБ качестве медиатора. Предел обнаружения составил 1 миллион молекул (10–18 моль) нуклеиновой кислоты без амплификации и около 50 молекул в случае реакций амплификации. Время анализа 15—30 мин.

Очень интересен и перспективен ДНК-сенсорный метод, чувствительность которого к ДНК может быть повышена путем введения в процесс анализа дополнительных молекул метки — биотина [34]. Как и в предыдущих методах, проводится гибридизация ДНК, меченной биотином, затем связывание биотина на поверхности с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза. Метод усиления аналитического сигнала основан на способности пероксидазы окислять производные тирамина с образованием промежуточных высокоактивных радикальных частиц, которые затем могут ковалентно связываться с поверхностью белковой глобулы фермента в непосредственной близости от активного центра фермента — источника их образования. Радикальные частицы, иммобилизованные на поверхности вблизи фермента, могут быть также выявлены конъюгатом стрептавидинпероксидаза. Таким образом, на поверхность вводятся дополнительные молекулы пероксидазы, что обеспечивает расширение диапазона аналитического сигнала.

Заключение

В настоящее время потребность в биосенсорах огромна, поскольку они не требуют сложного или дорогого оборудования, могут использоваться в полевых условиях и даже быть имплантированы в человеческий организм для непрерывного мониторинга различных биологически активных соединений.

Для расширения аналитических возможностей электрохимических биосенсоров ведутся работы по усовершенствованию методов иммобилизации биокомпонента на электроде, по миниатюризации сенсорных элементов, по увеличению стабильности биочувствительных элементов. Основное ограничение использования биосенсоров в области медицины и охраны окружающей среды связано с необходимостью применения одного типа сенсора для определения только одного соединения.

Развитие принципов биосенсорного анализа направлено на решение задачи определения нескольких веществ одновременно. В мультибиосенсорных устройствах пероксидаза хрена сохраняет свои преимущества как компонент сопряженных ферментных систем, так и в качестве метки биораспознающего элемента.