Лабораторная диагностика

Материалом для исследования служат мокрота, моча, ликвор, пунктат лимфоузла, биоптаты тканей.

Бактериоскопический метод. Окрашивают мазки по Циль-Нильсену, выявляют мелкие красные палочки. При окраске флюоресцентными красителями (аурамином, родамином) микобактерии дают желто-белое свечение в люминесцентном микроскопе.

При малом количестве возбудителя используют методы обогащения.

Гомогенизация – материал обрабатывают щелочью, фибрин при этом растворяется, а возбудитель высвобождается. Из осадка после центрифугирования готовят мазки.

Флотация – гомогенизированную мокроту обрабатывают ксилолом или бензолом и тщательно встряхивают. Возбудитель всплывает в силу гидрофобности вместе с пеной. Из нее готовят мазок и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Бактериологический метод. Материал обрабатывают серной кислотой и засевают на яичные среды.

Для идентификации M. tuberculosis определяют основные свойства возбудителя.

Оценивают характер роста – обнаруживают сухие, бородавчатые, кремовые колонии (R-форма); длительность роста составляет 20-60 дней. Для микобактерий туберкулеза характерен рост только при температуре 37-38⁰С; они не растут на простых средах и средах с салицилатами;

Выявляют наличие корд-фактора. Его определяют по методу Прайса – на стекло наносят исследуемый материал, обрабатывают серной кислотой для уничтожения кислоточувствительной флоры и погружают препараты в цитратную кровь. Через 3-4 дня препараты извлекают, окрашивают по Циль-Нильсену, при микроскопии видны «косы» палочек, при отсутствии корд-фактора возбудитель располагается аморфно.

У микобактерий туберкулеза наблюдается положительный ниациновый тест (среда с хлорамином В желтеет при накоплении никотиновой кислоты). Также они обладают термолабильной каталазой; восстанавливают нитраты в нитриты; выделяют уреазу; к микобактериям туберкулеза чувствительны морские свинки.

Для внутривидовой дифференциации используют фаготипирование штаммов микобактериофагами.

Mycobacterium bovis вирулентны в S-форме; колонии кремовые, гладкие; ниациновый тест отрицательный; рост до 40 дней; каталаза термолабильная; выделяют уреазу; не восстанавливают нитраты; рост только при температуре 37-40⁰С.

Mycobacterum africanum – рост 31-40 дней; ниациновый тест положительный; вирулентны в S-форме; каталаза термолабильна; не восстанавливают нитраты; выделяют уреазу. Остальные свойства как у M. tuberculosis.

Микобактерии туберкулеза необходимо дифференцировать от атипичных кислотоустойчивых бактерий, вызывающих микобактериозы.

Атипичные кислотоустойчивые бактерии имеют оранжевый пигмент, вирулентны в S-форме, растут на средах с салицилатами, имеют термостабильную каталазу, рост через 10-20 дней при температуре 22-45⁰С, нет корд-фактора.

Кислотоустойчивые сапрофиты (M. smegmatis и др.) в отличие от предыдущих возбудителей, растут на простых средах, длительность роста 3-4 дня, имеют S-форму, оранжевый пигмент, нет признаков болезнетворности, чувствительны к спирту.

Дифференциальные признаки микобактерий представлены в таблице.

Таблица

 

Дифференциация микобактерий

 

Свойства	M.tuberculosis	Атипичные микобактерии	Сапрофиты
Характеристика колоний	R-форма, сухие, морщинистые, бородавчатые, «цветная капуста»	S-, R-формы, гомогенные	S –форма, сочные
Пигментообразование	Цвета «слоновой кости»	Желтые, оранжевые	Беспигментные, желтые, оранжевые
Оптимальная температура роста	370С	20-420С	20-450С
Скорость роста на средах	Медленный (2-6 недель)	Медленный (3-4 недели)	Быстрый (2-3 дня)
Ниациновый тест	+	-	-
Каталазная активность: термостабильная каталаза; термолабильная каталаза	+   -   +	+   +   -	+   +   -
Наличие корд-фактора	+	-	-

 

Для ускоренного культивирования микобактерий применяют автоматизированную систему BACTEC с радиометрическим определением роста возбудителей. Система включает жидкую питательную среду, содержащую меченую изотопом [¹⁴C] пальмитиновую кислоту. При своем размножении микобактерии утилизируют пальмитиновую кислоту с образованием радиоактивного СО₂. Его обнаружение указывает на присутствие возбудителей. Сроки детекции бактерий в этой системе составляют 7-8 дней.

Биопроба применяется при стертых формах. Морским свинкам внутрикожно втирают исследуемый материал. Через 10-14 дней появляется долго не заживающая язва, и реакция Манту у них становится положительной.

Для определения инфицирования, обострения заболевания или оценки специфического иммунитета применяют кожно-аллергическую пробу – реакцию Манту с туберкулином.

Внутрикожно во внутреннюю поверхность предплечья вводят 2 единицы туберкулина PPD (PPD – очищенный белковый дериват). Если организм инфицирован, то через 24-48-72 часа наблюдается инфильтрация и гиперемия, т.е. развивается ГЧЗТ. У больных туберкулезом диаметр инфильтрата на 6 мм и более превышает показатель вакцинированных лиц.

У больных ВИЧ-инфекцией с туберкулезом проба Манту может быть отрицательной.

В последнее время для оценки ГЧЗТ при туберкулезе начинают применяться иммунологические клеточные тесты, проводимые in vitro. В их основе лежит увеличение продукции Т-лимфоцитами больных γ-интерферона после взаимодействия иммунных клеток со специфическими АГ микобактерий.

Для эпидемиологической характеристики возбудителей и определения его антибиотикоустойчивости используют методы генодиагностики, включая различные варианты ПЦР.

Серологический метод носит вспомогательный характер; для выявления антител используют РПГА, ИФА.