Аналитические основы энзимологических исследований. Правила взятия и хранения биоматериала. Кл-я методов опр-я акт-ти ферментов. Методы выражения энзиматической активности

Ферментная диагностика используется в 2 главных направлениях:

1) для распознавания наследственных нарушений обмена в-в (первичные насл-е энзимопатии)

2) для диагностики и дифдиагностики приобретенных заболеваний (вторичные приобретенные энзимопатии).

В основе любого пат. процесса лежит нарушение ферментных сис-м. Ферменты позволяют выявить особенность протекания болезни почти на молекулярном уровне.

Обычно опр-т не один какой-то фермент, а несколко ферментов, т.е. ферментный спектр.

Изм-е акт-ти ферментов крови подразделяют на параферментемии (появление в крови ферментов, в норме не встречающихся в ней) и дисферментемии (гиперферментемия – повышение акт-ти фермента, постоянно прис. в плазме крокви; гипоферментемия – понижениеакт-ти фермента).

Основным биолог материалом для исследования активности ферментов является сыворотка.

Кровь берут утром натощак (между 8 и 10 часами), до физ нагрузки и проведения диагност процедур. За сутки до взятия крови исключ алкоголь, после 2 ч ночи исключить курение, прием пищи и жидкости, если для выполнения большинства тестов взятие крови производят после 8-12 ч голодания, то для определения триацилглицеринов требуется выдержать 10-12 часовой интервал после приема пищи.

Следует помнить, что при пребывании человека в течение нескольких часов в горизонтальном положении объем плазмы в русле крови оказывается на 10-15% больше, чем у пациента, сохраняющего обычный двигательный режим. Отсюда концентрация веществ в крови человека, лежавшего в течении более часа, всегда ниже, чем у него же после ходьбы. Положение тела оказывает влияние на концентрацию общего белка, альбумина, креатина, холестерола, триацилглицеринов, активность ЩФ, АСТ и др компонентов плазмы.

При взятии крови из вены время сдавления сосудов жгутом по возможности должно быть минимальным. Больному не следует сжимать и разжимать пальцы, так как это вызывает местный стаз и гипоксию, а также всдвиги в распределении некоторых веществ (холестерола, калия, натрия, кальция и др) между форменными элементами крови и ее жидкой частью. Кровь берут из крупной вены (локтевая) в чистую сухую стеклянную или пластиковую пробирку. Что м. привести к гемолизу – узкий жиаметр иглы, длительный забор крови, интенсивное давление на поршень шприца при выливании крови в пробирку, интенсивное встряхивание и.т.д. Если пациенту проводилась в/в терапия, то кровь берут дальше от места инфуци (из вены другой руки).

При лизисе сосредоточенных в сгустке эр находящиеся в них ферменты переходят в сыворотку крови, этим объясняется более высокая активность энзимов (ЛДГ, АСТ, АЛТ, КФ, содержащихся в значительных количествах в тромбоцитах и эр и освобождающихся из них при свертывании крови) в сыворотке, чем в плазме, поэтому для опред этих ферментов лучше использовать плазму.

Для получения сыворотки антикоагулянт не добавляют. Доставленные пробирки закрытые ватной пробкой, помещают в термостат на 10-15 мин для прогревания, затем осторожно проводят проволокой по внутренней стенке пробирки, чтобы ускорить получение сыворотки, затем центрифугируем.. Пробирку с кровью допускается выдерживать при комнатной темпер в течении 1-1,5 ч после взятия. Снимать плазму (сыворотку)не позже 1 часа. Если сыворотка нужна немедленно, то кровь центрифугируют 15 мин при 1500 об, затем сыворотку в центрифужку и вновь центриф 10 мин.

Обычно сыворотку крови содержат в холодильнике при 0-4 С, допускается ее хранение в течении месяца, если ее заморозить сразу после взятия. Активность ЩФ более стабильна при комнатной температуре. КФ определять только в свежей сыворотке.