Методы определения активности ферментов

Методы определения активности ферментов могут быть под­разделены на 2 основные группы:

а) колориметрические методы, основанные на инкубации сы­воротки с субстратом в соответствующем буфере в течение опре­деленного времени, по истечении которого ферментативную ре­акцию останавливают и образующиеся продукты определяют при помощи подходящей химической реакции либо замеряют коли­чество оставшегося субстрата;

б) спектрофотометрические методы, с помощью которых не­прерывно или периодически в ходе ферментативной реакции определяют потребление субстрата или кофермента либо образо­вание продукта. Эти методы часто называются кинетическими методами, поскольку измерения каталитической активности за­висят от кинетики непрерывной регистрации реакции. Боль­шинство кинетических методов основаны на оптическом тесте Варбурга с применением пиридинкоферментов (НАД, НАДН₂)'

Ферменты преим-но локализуются внутри клеток, где и проявляется их действие. Поэтому ↑ акт-сти ферментов в плазме (сыв-ке) крови при целом ряде заб-ний связано прежде всего с ↑ проницаемости плазма­т. мембраны, мембран лизосом, некрозом клеток и вы­ходом энзимов из поврежден. органов и тканей в кровь. При этом содерж-е и акт-сть фермента в повреж­ден. органе ↓, а в сыворотке (плазме) крови - ↑. Полагают, что в рез-те общей реакции орг-ма ферменты переходят в плазму не только из поврежд. ор­гана, но также из клеток других органов и тканей, не затронутых патологическим процессом.

Для исследования акт-сти ферментов чаще всего используется плазма или сыворотка крови. В процессе свертыва­ния крови и последующей ретракции сгустка высвобождаются содержащиеся в тромбоцитах БАВ, под влиянием которых возрастает акт-сть многих энзимов. Наб­людаемое в процессе свертывания разрушение форменных эле­ментов (эритроцитов и др.) крови обусловливает дальнейшее увели­чение ферментативной активности, оказывающейся, как правило, в сыворотке более высокой, чем в плазме. Этим, в частности, объясняется и известное предостережение избегать гемолиза крови.

Хранение сыв-ки сопровождается ↓ активности ферментов. Для бол-ва из них активность не изменяется при комнатной температуре в течение ~-8 ч, при 4 оС _ около недели, а в заморож. состоянии - на про­тяжении месяца. При опред. акт-сти фермен­тов в плазме; следует учитывать, что многие антикоа­гулянты способны и'нгибировать энзиматическую деятельность. Известно, что оксалаты подавляют активность ЛДГ, ЭДТА инги­бирует активность кислой и щелочной фосфатаз.