Обнаружение возбудителей ботулизма

Первый день. Для обнаружения возбудителей ботулизма производят посев 3-5 мл из 1/3 предварительно подготовленного материала на жидкие питательные среды. Для первичных посевов используют печёночно-глицериновую среду, бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом и трипсином, бульон Хоттингера, среду Китт-Тароцци, среду питательную для контроля стерильности и др. Обязательным является наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиновых – отварного пшена и ваты. Пробирка или флакон должны быть заполнены питательной средой не менее чем наполовину. Перед посевом среды нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут, после чего быстро охлаждают, добавляют 0,5% глюкозы и производят посев. Посевы необходимо производить в среды в больших пробирках или во флаконах ёмкостью по 100-200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной в 0,5 см. Лучше засевать исходный посевной материал в большой объём среды (70,0-150 мл). Посев производят в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60^оС 15 минут. В этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры C.botulinum типа Е, которые погибают при 80^о С; другой флакон прогревают при 80^о С 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60^оС, инкубируют при 28^оС, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80^оС, инкубируют при 35^оС. Первые два флакона исследуют на C.botulinum, типов Е и F, вторые два флакона на C.botulinum типов А, В, С. Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образом, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может привести к выделению чистой культуры из такого посева. Рост C.botulinum, характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша. Для выявления C.botulinum типа Е в среду перед посевом следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1% либо эквивалентное количество панкреатина. Через 48 часов от начала роста из всех флаконов с соблюдениям стерильности берут пробы культуральной жидкости (по 10-15 мл) и подвергают их исследованию. Предварительно готовят мазки, красят их по Граму и микроскопируют.

С культуральной жидкостью ставят реакцию нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов А, В, C, Е, F. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно. При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для C.botulinum, а также ботулинического токсина дают заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма и наличии в нём ботулотоксина. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.

Если в посевах обнаруживают микробы, по морфологии сходные с C.botulinum, а токсин отсутствует, то следует перед постановкой реакции нейтрализации провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином для обнаружения ботулинических токсинов типа Е, непротеолитичных штаммов типа В и некоторых штаммов типа F, а также провести выделение и изучение чистых культур.

Для выделения чистых культур ботулинических палочек применяют 1-1,5% агар с глюкозой, приготовленной на бульоне Мартена или бульоне Хоттингера, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15-18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45-50^оС. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают её в исследуемый материал (чаще это первичный посев материала исследуемого) и переносят последовательно из пробирки в пробирку, тщательно перемешивая, после чего агар перемешивается ещё раз путём перекатывания пробирок между двумя ладонями. Охлаждённые пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35-37^оС. На каждый посев следует брать 5-8 пробирок столбика агара. Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5-10 мл культуры в пробирку и подвергнуть её прогреванию на водяной бане при 80^оС 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.

Через 1-2 суток в последних пробирках появляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотнённым центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии пересевают на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшуюся часть колонии микроскопируют. Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах. Посев на чашки. Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного или печеночного агара, разлитого толстым слоем (приблизительно 3-5мм) в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель ещё на 2-3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат крышкой кверху и выращивают при температуре 35-37^о С. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1-0,2 см, окружённые зоной гемолиза. Виду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении C.botulinum, особенно типа Е из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов. Рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на устойчивости спор палочки ботулизма к 50% спирту.

К 2 мл культуральной жидкости 2-3-дневной инкубации при 28^оС, содержащей ботулинический токсин типа Е, добавляют равный объём этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из неё делают высев на 2-3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлаждённого до 50^оС агара). Через 48 часов инкубации при 35^оС в анаэростате, среди колоний посторонней микрофлоры, C.botulinum дают небольших размеров колонии, окружённые «жемчужным поясом». Эти колонии высевают в пробирки со средой Китт-Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры C.botulinum типа Е.

Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.

С поверхности чашки колонии снимают петлёй или пастеровской пипеткой и засевают в пробирки со средой Китт-Тароцци с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяют на чистоту путём микроскопирования и на наличие токсина путём постановки реакции нейтрализации на мышах.