Обнаружение и идентификация токсина

Практическая работа № 52.

Тема занятия: Микробиологическая диагностика ботулизма.

 

Составила преподаватель: Якимова Л.М.

 

 

Минск

 

Пробы исследуют одновременно по двум направлениям: производят обнаружение ботулинических токсинов и ботулинических микробов. Две трети предварительно подготовленной пробы используют для обнаружения ботулинических токсинов, одну треть – для посевов с целью обнаружения ботулинических микробов. Часть пробы, которую исследуют на наличие токсинов, выдерживают в течение 1-1,5 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 2500-3000 об/мин, в течение 15-20 минут. Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или надосадочной жидкостью ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксической сывороткой и реакцию пассивной геммагглютинации (РПГА) с диагностикумом эритроцитарным ботулиническим поливалентным типов АВЕ иммуноглобулиновым сухим и диагностикумом эритроцитарным ботулиническим моноспецифическим А, В и Е иммуноглобулиновым сухим.

Обнаружение ботулинических токсинов в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсинов следует взять для каждой пробы 4-х мышей весом 16-18 граммов. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один или несколько типов ботулинических токсинов, предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулинических диагностических сывороток типа А, В, С, Е, F. Для постановки реакции нейтрализации готовят смесь из равных объёмов моновалентных сывороток типов А, В, С, Е, F. Из каждой исследуемой пробы наливают в две пробирки равное количество (1,5-2,4мл) фильтрата или надосадочной жидкости. Остаток сохраняют в холодильнике для дальнейших исследований. В одну пробирку (контроль) добавляют 0,6 мл физиологического раствора, в другую (опыт)-0,6 мл смеси моновалентных сывороток. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут, после чего содержимое каждой пробирки вводят в объёме 0,7-1,0 мл двум белым мышам. Исследуемый материал из каждой пробирки следует вводить разными шприцами или сначала контроль, а затем опыт. Наблюдение за животными проводят в течение 4-х дней, однако если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставят реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками. Ботулинический токсин не даёт молниеносной гибели животных (в течение нескольких минут или секунд), мыши погибают не раннее, чем через 4-5 часов. При наличии ботулинического токсина погибают две мыши контрольные, которым вводили несмешанный с сыворотками фильтрат, опытные мыши остаются живы. Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащённое дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.

В случае гибели всех 4-х мышей, т.е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).

Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250-300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток А, В, С, Е, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или надосадочной жидкости), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.

В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставят развёрнутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.

В 6 пробирок разливают по 2,4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа А, во вторую – типа В, в третью – типа С, в четвёртую- типа Е, в пятую – типа F, в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Все сыворотки наливают разными пипетками. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или внутибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки отдельными шприцами.

Учёт результатов проводится через 4-6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4-х дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина. Иногда происходит нейтрализация сывороткой Е ботулинического токсина F и наоборот. Поэтому при получении положительной реакции нейтрализации одновременно с сыворотками типа Е и F следует провести дифференциальную диагностику. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими сыворотками типа Е и типа F, разведёнными до концентрации 1 МЕ/мл. Для этого в три пробирки наливают по 2, 4 мл испытуемого экстракта, затем в первую пробирку наливают 0,6 мл сыворотки типа Е, во вторую – 0,6 мл типа F, разведённых до концентрации 1МЕ/мл, в третью - контрольную – 0,6 мл ИХН. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа Е, то в экстракте имеется токсин типа F. Если на ряду с контролем погибают мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой типа Е, то в экстракте токсин типа Е. Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как её обычно бывает мало. Следует сразу поставить развёрнутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками только типов А, В, Е, т.к. остальные типы ботулинических палочек встречаются очень редко. Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа А – 0,4 мл, во вторую – типа В, в третью – типа Е. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного, контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.

Реакция пассивной геммагглютинации (микрометодом) позволяет получить ответ о содержании ботулинических токсинов в воде, воздухе, смывах, продуктах питания, фураже, силосе и т.д. через 3-4 часа. При этом используются диагностикумы эритроцитарные ботулинические моноспецифические типов А, В и Е и поливалентные типов АВЕ иммуноглобулиновые сухие.