Стадии метода хроматографии в тонком слое

Проведение анализа методом ТСХ включает следующие этапы:

1. Подготовка пластинок с толстым слоем сорбента

2. Подготовка подвижной фазы

3. Подготовка камеры для хроматографирования

4. Подготовка растворов анализируемого образца и «свидетелей»

5. Нанесение проб подготовленных растворов на пластину

6. Процесс хроматографирования

7. Обнаружение зон компонентов смеси на хроматограмме

8. Анализ хроматограмм, заключение о качественном составе

9. Количественный анализ компонентов исследуемой смеси

10. Обработка полученных данных; заключение о количественном содержании. Вывод о соответствии исследуемого образца требованиям НД.

 

1. Подготовка пластинок. Анализ можно проводить на пластинках, выпускаемых промышленным способом или же приготовленными вручную.

 

2. Подвижная фаза готовится смешиванием в объемных соотношениях указанных в методике растворителей. Они должны быть предварительно очищены, не реагировать с веществами разделяемой смеси и между собой. Растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворители должны легко удаляться с пластинки, быть недефицитными и безвредными для организма.

 

3. Камеры для хроматографирования представляют собой стеклянные емкости различного размера цилиндрической или прямоугольной формы с плоским дном и притертыми пришлифованными крышками или стеклом. Приготовленную подвижную фазу заливают в камеру, высота слоя жидкости должна быть не менее 1 см.

В процессе хроматографирования все пространство камеры

должно быть насыщено парами подвижной фазы. При недостаточном насыщении вследствие неравномерного испарения растворителя пластинки возможно увеличение пробега вещества от середины к краям пластины («краевой эффект»). Насыщение камеры может быть достигнуто с помощью смоченной подвижной фазой фильтровальной бумаги, которой обкладывают стенки камеры.

Время насыщения различно – оно определяется свойствами

растворителями, входящих в состав подвижной фазы, и объемом

камеры.

 

4. Для приготовления раствора исследуемой смеси и «свидетелей» выбирают летучий органический растворителей, который должен легко удаляться, т.к. на готовой к хроматографическому процессу пластинке пробы должны находиться в сухом виде.

В качестве «свидетелей» («метчиков») используют Государственные стандартные образцы (ГСО), рабочие стандартные образцы (РСО) и стандартные образцы веществ свидетелей (СОВС).

 

5. Нанесение проб подготовленных растворов на пластинку проводят с помощью микрошприца, калиброванных микропипеток или капилляров. Объем наносимого раствора, как правило, 1-10 микролитров с содержанием веществ от единиц до 100-200 мкг.

Объем и количество наносимого на пластинку исследуемого раствора зависит от цели анализа и характера анализируемого объекта. Нанесение больших количеств веществ приводит к образованию пятна исследуемого вещества, часто растянутого вдоль движения подвижной фазы, что может помешать идентификации других веществ, содержащихся в меньших количествах, если они находятся на хроматограмме достаточно близко.

Пробы наносят на так называемую линию старта, которую проводят иглой на расстоянии не менее 1,5 см от того края пластинки, который будет погружен в подвижную фазу. Минимальное расстояние между пробами 1 см. При нанесении поступают таким образом, чтобы диаметр наносимого раствора был как можно меньшим и компактным во избежание последующего «растекания» пятен исследуемых веществ по хроматограмме. Пробы подсушивают на воздухе до полного удаления растворителя.

 

6. Процесс хроматографирования. Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру, опуская ее в подвижную фазу со стороны линии старта и устанавливают в вертикальном положении, пластинки с незакрепленным слоем устанавливают под углом 15-20^о.

Растворитель тотчас же начинает двигаться по пластинке – заметна горизонтальная полоса – фронт движения растворителя. При прохождении через точки, в которые нанесены пробы исследуемой смеси, начинают протекать процессы распределения и адсорбции, в зависимости от которых вещества смеси располагаются на разном удалении от линии старта.

Оптимальной длиной пробега растворителя считают 10 см (заранее отмечают на хроматограмме), но она может меняться в зависимости от конкретной цели, разделяющей способности сорбента и подвижной фазы.

Время хроматографирования зависит от толщины слоя сорбента, его природы, состава подвижной фазы.

 

7. Обнаружение зон компонентов смеси на хроматорамме. После завершения процесса хроматографирования пластинку извлекают из камеры и подсушивают в вытяжном шкафу на воздухе или в сушильном шкафу до полного удаления растворителя. Затем приступают к проявлению. Совокупность пятен, полученных после хроматографирования анализируемой смеси и проявления (детектирования) ее компонентов тем или иным способом, называется хроматограммой.

Обнаружить зоны отдельных ингредиентов на хроматограмме можно следующими способами:

 

Физическими:

- по собственной окраске, если хроматографируемое вещество окрашено;

- по флуоресценции веществ при облучении пластин УФ-светом.

 

Химическими – по окраске пятен, получаемых в результате реакций, проходящих при обработке парами или опрыскивании хроматограмм какими-либо реагентами, образующими окрашенные соединения с исследуемыми веществами. Подобные реагенты должны быть высокочувствительными, т.к. количество вещества на хроматограмме очень мало.

Обычно после обработки реагентами пластинки подсушивают, пятна исследуемых веществ на хроматограмме обводят иглой, отмечают центр пятна.

 

8. Анализ хроматограмм, заключение о качественном составе.

Положение вещества на хроматограмме характеризуется величиной R_f, называемой коэффициентом подвижности. Она представляет собой отношение расстояния, пройденного веществом к расстоянию, пройденным растворителем. Расстояние, пройденное веществом, определяется как расстояние от линии старта до центра пятна (рис. 1). Величина R_f является качественной характеристикой данного вещества для конкретных условий и зависит от природы сорбенты, толщины слоя, природы подвижной фазы, температуры, длины пробега растворителя. В некоторых случаях при определении подлинности используют величину Rs, представляющую собой отношение R_f анализируемого вещества к R_f вещества, принимаемого за стандарт (эталон, свидетель).

Качественный анализ (идентификацию компонентов) проводят по величине R_f или с помощью стандарта («свидетеля», «метчика») того вещества, наличие которого предполагают в анализируемой смеси.

 

 

• •

Проба стандарт

 

 

h₂

 

 

h₁

Рис. 1. Образец хроматограммы с обозначениями для расчета R_f

 

R_f = h₁/ h₂

h₁ – расстояние, пройденное веществом;

h₂ – расстояние, пройденное растворителем.

 

Rs = R_{f 1}/ R_{f ст}

R_{f 1} – коэффициент подвижности анализируемого вещества;

R_{f 2} - коэффициент подвижности стандарта.

 

 

9. Количественный анализ компонентов исследуемой смеси. Количественный анализ компонентов анализируемой смеси с применением ТСХ может осуществляться двумя способами:

- непосредственно на хроматограмме без экстракции разделенных

веществ;

- после элюирования (экстракции, вымывания) вещества с хроматограммы подходящим растворителем и анализа элюата с использованием, как правило, высокочувствительного метода с учетом малого содержания анализируемого вещества.

Непосредственно на хроматограмме вещества определяют методами планиметрии и денситометрии.

Метод планиметрии заключается в определении площади пятна (в мм²) в сравнении с площадью пятна стандарта, содержание вещества в котором известно. Площадь пятна определяют с помощью планиметра – прибора, предназначенного для определения площадей плоских фигур произвольной формы, или, если прибор отсутствует – с помощью миллиметровой бумаги.

При денситометрическом определении измеряют интенсивность окраски пятна анализируемого и стандартного вещества с помощью прибора – денситометра, а затем как в методе фотоэлектроколориметрии рассчитывают содержание вещества в анализируемой смеси.

Методы второй группы, основанные на количественном анализе веществ после элюирования их с хроматограммы, применяют на практике значительно чаще.

При этом может быть два варианта:

- экстракция окрашенного продукта анализируемого вещества, образованного им с каким-либо цветореагентом, и последующее определение полученного раствора фотоэлектроколориметрическим или спектрофотометрическим методом;

- экстракция неокрашенного вещества и последующее его определение подходящим для него методом: фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия и др.

Элюирование вещества проводят в сосуде, куда предварительно соскабливают с пластинку ту зону сорбента, в которой находится пятно анализируемого вещества, добавляют определенный объем экстрагента, встряхивают, фильтруют и фильтрат анализируют.