Стадии репликации: инициация, элонгация, терминация (на примере E.coli).

У большинства организмов репликация осуществляется как двунаправленный процесс. У некоторых бактериальных плазмид и вирусов может происходить однонаправленная репликация по типу разворачивающегося рулона или катящегося кольца. В репликации так же, как и в процессах транскрипции и трансляции выделяют три основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Рассмотрим процесс репликации на примере Е.coli.

Инициация начинается с проверки ДНК на целостность путем отрицательного суперскручивания с помощью ДНК-гиразы. Если в ДНК есть хоть 1 разрыв, суперскручивание не происходит и необходима репарация ДНК. Для перевода ДНК в релаксированное состояние (это важно для раскручивания), гираза делает двуцепочечные разрывы в ДНК и распутывает петли. Далее белок-инициатор (dna A) прикрепляет богатую АТ-парами область ориджина к выросту ЦПМ. Топоизомераза 1 делает одноцепочечный разрыв вблизи ori C, прикрепляется к 5^/-концу разрыва, а 3^/-конец начинает раскручиваться относительно интактной цепи с образованиями репликативной вилки, где и происходит сборка ферментативного аппарата репликации.

На лидирующей цепи неспецифическая РНК-полимераза осуществляет синтез небольшого РНК-вого транскрипта, к которому в дальнейшем ДНК-полимераза ІІІ будет присоединять ДНК-овые нуклеотиды (если транскрипт образовался в «неправильном» месте, РНК-аза Н гидролизует его обеспечивая избирательность синтеза). Перед транскриптом на цепь ДНК «садится» хеликаза rep и SSB белки. Последние удерживают разведенные цепи ДНК, не давая им ренатурировать, а также убирают случайные элементы с матричной цепи ДНК. Далее к цепи присоединяется ДНК-полимераза III.

На отстающей цепи формируется сложная хеликаза-dnaBdnaC путем последовательного присоединения 6 белков dna C и 6 белков - dna B. Сюда же присоединяются белки n, n^/, n^//, i и праймаза. Формируется сложная частица – праймосома, которая в комплексе с ДНК-полимеразой ІІІ образует реплисому. На эту цепь также «садятся» SSB белки. Перед началом элонгации на каждой цепи оказывается по 1 молекуле ДНК-полимеразы III.

Элонгация осуществляется по-разному на лидирующей и отстающей цепях.

На лидирующей – идет непрерывный синтез цепи ДНК, путем последовательного присоединения нуклеотидов к РНК-транскрипту. Предшественники синтеза ДНК – активированные 3-фосфонуклеозиды. От 3-фосфонуклеозида отщепляется пирофосфат, а оставшийся 5^/-фосфорнокислый конец присоединяется к 3^/-гидроксилу предыдущего нуклеотида. Синтез идет в направлении 5^/ - 3^/.

На отстающей цепи сначала праймазы синтезируют РНК-овые праймеры – затравки, к которым ДНК-полимераза III присоединяет последовательно ДНК-овые нуклеотиды с образованием фрагментов Оказаки (по 1000-2000 нуклеотидов каждый). В результате дочерняя цепь ДНК становится фрагментарной и состоит из чередующихся РНК-овых затравок и ДНК-овых фрагментов Оказаки. Для перевода всей цепи на язык ДНК, к процессу подключается ДНК-полимераза I, которая с помощью своей 3^/-экзонуклеазной активности убирает РНК-овые праймеры, а с помощью полимеризующей активности застраивает образующиеся бреши ДНК-овыми нуклеотидами. Все ДНК-овые фрагменты сшиваются лигазой.

Так как матричные цепи ДНК антипараллельны, то синтез дочерних цепей идет в разном направлении, однако репликативная вилка, включающая все ферменты, движется синхронно в направлении разведения матричных цепей. Оказалось, что это возможно благодаря образованию на отстающей цепи петли (в месте расположения ферментов), которая скользит по ходу репликации вдоль ДНК. Проблема антипараллельности цепей решается за счет поворота последовательности ДНК в петле на 180º. Перед движущейся репликативной вилкой происходит кручение молекулы ДНК со скоростью 6 тыс. об/мин, при этом в молекуле образуются спутанные петли. В их расплетании важную роль играют топоизомеразы.

Терминация. При двунаправленном синтезе репликация начинается в ori C, а заканчивается в терминус-центре (terminus C). Вилки, движущиеся навстречу, как бы сбивают друг друга. При однонаправленной репликации процесс начинается и заканчивается в ori C. Вновь образовавшаяся ДНК прикрепляется к выросту ЦПМ и, за счет локального синтеза мембраны 2 молекулы ДНК разводятся к полюсам клетки. Они могут оказаться сцепленными, т.е. образуются катенаны ( синоним катемеры). В их рассоединении участвуют гираза и топоизомераза I. После образования межклеточной перегородки между двумя молекулами ДНК формируются 2 новые дочерние клетки.

Процессинг. Сразу после репликации во вновь образованной ДНК в сайтах (участках) рестрикции происходит метилирование аденина, гуанина и цитозина. Это необходимо для мечения собственной ДНК и предотвращения разрезания ДНК в этих сайтах собственными рестриктазами (эндонуклеазами). Сама по себе система рестрикции нужна для направленного уничтожения чужеродной ДНК (например, вирусной), проникающей в клетку.