Очистка суспензий вируса ящура с применением полиэтиленгликоля

В литературных источниках можно обнаружить большое количество различных методов очистки вируссодержащих суспензий от балластных белков, каждый их которых взаимосвязан или направлен на решение определенной проблемы. Естественно, каждому из методов присущи как достоинства, так и недостатки. Основным недостатком является трудность получения высокоочищенных суспензий вируса ящура. Если в исходной вируссодержащей суспензии, освобожденной от крупной взвеси простой фильтрацией, содержится 500-600 мг% балластных белков, то термину «высокоочищенная» в нашем представлении соответствует суспензия, содержащая не более 5мг% белков (99,0% очистка).

В связи с этим задача заключалась в получении достаточно простыми технологическими приемами максимально очищенных суспензий вируса ящура для электронно-микроскопических и других целей, например, концентрирования вируса методом ультрафильтрации.

Методика эксперимента состояла в следующем. Первый этап включал получение предварительно очищенной 10% суспензии лапинизированного вируса ящура с помощью хлороформа. Предварительная очистка должна быть проведена с таким расчетом, чтобы содержание белка в суспензии снизилось до 100-250 мг%.

На втором этапе проводили обработку суспензии кристаллическим ПЭГ, после растворения, которого и появления взвешенных белковых частиц, сразу же отделяли осадок центрифугированием при 2000 g в течение 15-20 мин. Полученный осадок растворяли в фосфатном буферном растворе в объёме равном объёму исходной суспензии (1:1).

 

Рис. 1. При растворении соли в воде (А) её молекулы начинают диффундировать и равномерно распределяются по всему объёму (Б). Если одновременно добавить к воде соль NaCl и полиэтиленгликоль (ПЭГ), то молекулы каждого из этих веществ диффундируют независимо друг от друга

Для очистки к суспензии добавляли 3-5% хлороформа и смесь эмульгировали в зависимости от объёма или на коллоидной мельнице, или на размельчителе тканей РТ-1. Эмульсию осветляли центрифугированием при 2000 g в течение 20 мин и использовали по дальнейшему назначению.

 

Установлено, что на этапе предварительной и конечной очистки инфекционная активность вируса ящура типов А₂₂ и О-194 сохраняется на одном уровне. Количество вирусных частиц на конечном этапе очистки, одновременно наблюдаемых на экране электронного микроскопа, возрастает в 2-3 раза (сканирование не менее 50 полей). Повышение концентрации 146S частиц и отсутствие продуктов распада в форме “пустых“ капсид, возможно, объясняется следующим образом:

- в предварительно очищенных суспензиях белки маскируют вирусные частицы, затрудняя их выявление под электронным микроскопом;

- кратковременное воздействие ПЭГ на вирус в процессе очистки позволяет максимально сохранить целостность вирусных частиц;

- растворение белкового осадка после ПЭГ в исходном объёме буферного раствора создает оптимальные условия для элюции вируса с макромолекул денатурированного белка;

Все эти обстоятельства побудили нас выполнить аналогичные исследования по очистке суспензий вышеизложенным методом после инактивации вируса димером этилэтиленимина (таблица 3.2). Для инактивации вируса и последующей очистки были взяты предварительно очищенные нативные суспензии, которые использовались в первой серии опытов. Все антигены были подвергнуты контролю по содержанию 146S частиц, определяемых методом электронной микроскопии, и по иммуногенной активности с установлением 50%-й иммунизирующей дозы (ИмД₅₀) на взрослых белых мышах массой 19-20 г.

Степень очистки инактивированных антигенов возрастает до 99,5-99,7%. Это обусловлено тем, что инактивирующее вещество действует не только на вирус, но и оказывает денатурирующее воздействие на балластные белки, способствуя их удалению при очистке. Из результатов контроля следует, что прирост количества вирионов в 1 мл высокоочищенной суспензии в 2-3 раза сопровождается повышением иммуногенной активности вакцинных препаратов в 1,5-1,6 раза. Как следует из накопленного наукой опыта, стандартизация антигена вируса ящура, идущего на изготовление вакцин, проводится по количеству 146S.

 

Метод электронной микроскопии позволяет получать при работе с высокоочищенными суспензиями более достоверную информацию, которая дополняет общепринятые характеристики по оценке нативного вируса ящура и его антигена.

Проведенные многими авторами исследования показали, что существует прямая связь между концентрацией 146S частиц и иммуногенной активностью вакцин при их контроле на лабораторных животных и крупном рогатом скоте [Котова М.В. и др., 1983].