Получение тканевых суспензий и их очистка методом центрифугирования
Определение Дисперсная система, в которой твердые частицы дисперсной фазы находятся во взвешенном состоянии в жидкой дисперсионной среде.
Суспензии получают методом диспергирования (измельчение твердых тел в жидкости) или конденсации (выделение твердой фазы из пересыщенных растворов). Суспензии подразделяют на грубодисперсные (размер частиц - от долей мм до 1 мкм) и мелкодисперсные (от 100 до 1000 нм). Первые неустойчивы и склонны к коагуляции. Суспензии, в которых частицы двигаются свободно, называют золями; если же частицы дисперсной фазы связаны в пространственную структуру, суспензию называют гелем. Наиболее простым и широко распространенным методом получения разбавленных суспензий является взбалтывание соответствующего порошка в подходящей жидкости с использованием различных перемешивающих устройств (мешалок, миксеров и т.д.) для получения концентрированных суспензий (паст) соответствующие порошки растирают с небольшим количеством воды. В разбавленных суспензиях частицы свободно перемещаются в жидкости, сцепление между частицами отсутствует и каждая частица кинетически независима. Разбавленные суспензии - это свободнодисперсные бесструктурные системы. В концентрированных суспензиях (пастах) между частицами действуют силы, приводящие к образованию определенной структуры (пространственной сетки). Таким образом, концентрированные суспензии - это связнодисперсные структурированные системы.
Самый простой способ получения суспензий - это когда в ступку помещают твердое вещество и предварительно тщательно растирают в сухом виде, а затем с небольшим количеством смачивающей жидкости (по правилу Дерягина на 1 г вещества берут 0,4-0,6 мл дисперсионной среды). Полученную массу смывают остальным количеством жидкости во флакон.
Выделение из биологического материала необходимых клеток После забора биологический материал поступает в лабораторию клеточного и тканевого культивирования, где подвергается тщательной обработке. Каждому образцу присваивают индивидуальный код, обеспечивающий удобство работы и конфиденциальность медицинской информации. Затем производят отбор минимального количества материала для анализа на инфекции, оговоренные в законе о трансплантации органов и тканей (СПИД, сифилис, гепатиты и др.). Следующим этапом является получение клеточной суспензии (взвеси отделенных друг от друга клеток) путем обработки биологического материала различными ферментами, главная задача которых – разрушить межклеточные связи, не повредив при этом клеточную оболочку. Поскольку любая ткань организма состоит из основных (необходимых для практического применения) и вспомогательных клеток, крайне важно осторожно отделить первые от вторых. Биотехнологи называют этот процесс сепарацией. Данный этап является принципиальным, так как если в одном флаконе будут находится клетки с различной скоростью пролиферации (скоростью деления клеток), то постепенно более активные вытеснят тех, кто менее быстр в размножении. При этом, для практических целей в большинстве случаев используются менее быстрые – «спокойные» клетки.
Применяют два метода сепарации клеток. Чаще всего используют сепарацию на градиентах плотности. При этом, раз за разом добавляя в клеточную суспензию жидкости, имеющие различную плотность, добиваются того, что на поверхности «плавают» необходимые клетки, которые собирают для дальнейшей работы – культивирования, заморозки или сразу используют для лечения. Этот метод прост и надежен, но не обеспечивает получения абсолютно чистой культуры – всегда есть «примеси» других клеток. Происходит это потому, что в основе метода сепарации на градиентах плотности лежит принцип разделения клеток по их весу; поэтому «примесь» будет включать в себя клетки, вес которых совпадает с таковым у основных. Нельзя не сказать, что применение ультрасовременной аппаратуры (в частности имеющегося в МЦБ «Биостэм» клеточного сепаратора фирмы "Dideco") позволяет получать чистые культуры, используя принцип сепарации на градиентах плотности, но это относится только к гемопоэтическим стволовым клеткам при их получении из периферической крови. Другой вид сепарации, гарантирующий получение чистых культур, основан на иммунологическом и физическом узнавании. В МЦБ «Биостэм» для выполнения «особо точных» работ используется методика иммуномагнитной сепарации. Что же это значит? Поскольку каждый тип клеток имеет на своей поверхности специфические белки (рецепторы), суть метода как раз и состоит в их определении. Для этого в клеточную суспензию добавляют моноклональные антитела, способные связываться только с конкретным рецептором, характерным для определенного типа клеток (иммунологическое узнавание). Секрет заключается в том, что в составе моноклонального антитела содержится атом железа. После того, как это антитело зафиксируется на поверхности нужной клетки, суспензию пропускают через магнит, к которому прилипают только те клетки, на поверхности которых присутствует атом железа (физическое узнавание).
Применение данного метода позволяет почти на сто процентов получить чистую (однородную) культуру живых клеток для последующих этапов изготовления биологического продукта. Недостатком этого метода сегодня является лишь его высокая себестоимость
Приготовление вируссодержащего органо-тканевого материала. Навеску органа измельчали с помощью ножниц и растирали в ступке с кварцевым песком. Готовили 10-20% суспензию органов в стерильном физиологическом растворе. Полученный гомогенат однократно замораживали при минус 400С в течение 3 час оттаивали при комнатной температуре и центрифугировали при 4000-5000 об/мин. в течение 30 минут. Надосадок использовали в качестве испытуемого антигена.
Размельчители тканей РТ-1
Коллоидная мельница Проблема очистки вируссодержащих суспензий от балластных белков актуальна не только в плане проведения молекулярно-биологических исследований, но и в отношении уже существующих вакцин из убитых или ослабленных возбудителей инфекционных болезней. Если вакцины будут загрязнены многочисленными плохо контролируемыми примесями из питательной среды, из клеток на которых выращивают вирус, то при иммунизации организма вирусными антигенами последним приходится конкурировать с тысячекратным избытком других антигенов, и, естественно, окончательный ответ получается слабым. Современная стратегическая линия в плане приготовления биопрепаратов высокого качества должна заключаться в получении матрицы максимально свободной от посторонних примесей, воздействуя затем на которую направленным образом или вводя контролируемые добавки, добиться заданных свойств или получить необходимую информацию. Кроме того, мы хотели бы акцентировать внимание на высказывании Г.Г. Девятых и Ю.В.Еллиева о том, что ”вещества высокой чистоты имеют самостоятельное непреходящее значение в сугубо научном плане. Повышение степени чистоты часто приводило к открытию новых свойств веществ и новых явлений, то есть повышение уровня знаний о веществе как форме существования материи… Оказалось, что ядерные и электрофизические свойства веществ более чувствительны к его чистоте, чем физико-химические“. Совершенно очевидно, что решение проблемы повышения степени очистки биопрепаратов вируса имеет первостепенное значение как для целей молекулярно-биологических исследований, так и для целей иммунопрофилактики инфекционных заболеваний. Кроме того, качество биопрепаратов, определяемое по содержанию остаточных белков или по степени очистки и по содержанию вирусоспецифического белка, является первичным критерием их стандартизации. Традиционно выделяют физические, химические и физико-химические способы очистки вируссодержащих суспензий. Выбор и применение этих методов основано на использовании физических и химических свойств частиц суспензии. Известно, что нативные вируссодержащие суспензии лапинизированного и культурального вируса ящура содержат относительно малые концентрации вирусных частиц и большое количество белков. Это обусловлено тем, что при содержании в клетке от 100 до 200 мг/мл белка в вирусный капсид включается только 8% индуцированного вирусом белка. В процессе репродукции вируса из разрушенных клеток освобождаются белки и вирусные частицы, образуя тем самым вируссодержащую белковую суспензию. Впервые для очистки суспензий вируса ящура Пиль в 1951 году использовал хлороформ. Данный метод выдержал испытание временем и стал классическим (388, 389). Впоследствии появились модификации данного метода с использованием различных органических растворителей, таких как метиловый спирт, н-бутанол, фреон-113, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен и др.
|
