Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Экспрессия генов в клетках прокариот в составе плазмид




Основная цель экспериментов по клонированию генов в составе рекомбинантных ДНК, которые предполагается использовать в биотехнологии, – подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. Для этой цели в биотехнологии используют специализированные векторы – экспрессионные (рис. 54) и соответствующие клетки-реципиенты.

Рис. 54. Основные функциональные модули экспрессионного вектора для прокариот

 

Способность к экспрессии – одно из самых важных свойств гена. За это свойство отвечают различные генетические элементы (последовательности нуклеотидов), которые необходимо встроить в векторную молекулу, несущую ген. Такие последовательности нуклеотидов принято называть регуляторными. Напомним, что к ним относятся последовательности, которые регулируют прочность и точность связывания с молекулой ДНК-матрицы фермента РНК-полимеразы, а также последовательности, сигнализирующие об окончании процесса транскрипции (промотор и терминатор соответственно). Кроме того, синтезируемая в процессе транскрипции мРНК должна содержать в своей структуре последовательности, которые обеспечат ее точное связывание с малой субъединицей рибосомы, тем самым, гарантируя правильную трансляцию. А это требует введения в структуру рекомбинантной ДНК участков, которые получили название сайты связывания рибосом (rbs – ribosome bind site). Упомянутые структурные элементы ДНК обеспечивают также и достаточную копийность как мРНК, так и синтезируемых полипептидов. Также при конструировании экспрессирующихся рекомбинантных ДНК необходимо предусмотреть место в клетке, где будет осуществляться экспрессия вводимых последовательностей ДНК: в цитоплазме в составе плазмидной ДНК или после интеграции в хромосомную ДНК хозяина. Кроме того, в структуре рекомбинантной ДНК должна содержаться информация и о месте локализации в клетке синтезируемого конечного продукта, т.е. белка. Однако, понятие системы экспрессии включает в себя не только структурные модули экспрессирующихся рекомбинантных ДНК, но и особенные характеристики клеток-хозяев, где планируется осуществлять экспрессию. В данном разделе будут рассмотрены некоторые общие моменты, которые необходимо учитывать при выборе системы экспрессии.

Следует отметить, что никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. В то же время, можно выделить наиболее важные свойства систем экспрессии:

1. Тип промотора и терминатора транскрипции.

2. Прочность связывания мРНК с рибосомой.

3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки).

4. Конечная локализация синтезируемого продукта.

5. Эффективность трансляции в организме хозяина.

6. Стабильность продукта в хозяйской клетке.

В исследовательской работе, а также для производства важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК наиболее часто используют систему экспрессии клеток E.coli. Это связано с тем, что генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков.

При рассмотрении генетических векторов для клонирования ДНК (см. раздел векторы) мы познакомились с семейством векторов pUC, в состав которых входят некоторые модули системы α-комплементации лактозного оперона E.coli. Эти регуляторные элементы транскрипции Lac-оперона дают возможность использовать эти векторы для экспрессии в клетках кишечной палочки чужеродных генов. Наличие сильного регулируемого промотора, имеющего большое сродство к РНК-полимеразе, обеспечивает эффективную транскрипцию после наращивания больших количеств клеточной массы.

В системе E.coli для экспрессии клонируемых генов наиболее широко используются следующие регулируемые промоторы: lac- и trp- оперонов E.coli; специально сконструированный tac-промотор, включающий -10- область lac-промотора и -35-область trp-промотора; левый или, pL, промотор бактериофага λ, а также промотор гена 10 бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

При наличии вклетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. Как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем малоколийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции клеток утрачивает плазмиды. Лишившиеся своих плазмид клетки обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились. В конечном счете такие клетки оказываются в культуре преобладающими, что через какое-то число генераций отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Чтобы избежать этой проблемы в лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Это приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены не только сохранялись в культивируемых клетках, но и не передавались другим микроорганизмам. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без экспрессии в составе плазмид и избежать утраты интересующих исследователя генов.


Поможем в написании учебной работы
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой





Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 983. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2022 год . (0.034 сек.) русская версия | украинская версия
Поможем в написании
> Курсовые, контрольные, дипломные и другие работы со скидкой до 25%
3 569 лучших специалисов, готовы оказать помощь 24/7