Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Создание геномных библиотек. Прокариоты





Разделение геномной ДНК на клонируемые элементы и введение этих элементов в клетки-хозяева дает возможность получить полную библиотеку генов данного организма. Специфика структурной организации генов прокариот и эукариот инициирует разработку и применение различной стратегии для их клонирования.

У прокариот искомая нуклеотидная последовательность (ДНК-мишень или ДНК интереса) часто составляет минимальную часть (0,02%) суммарной хромосомной ДНК. Для экстрагирования последовательности ДНК-мишени разработаны различные экспериментальные подходы, включающие следующие основные этапы:

· суммарную ДНК гидролизуют эндонуклеазами рестрикции и каждый из полученных фрагментов встраивают в вектор;

· проводят поиск специфической клеточной линии (клона), которая содержит нужную последовательность нуклеотидов;

· выделяют ДНК и анализируют.

Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК эндонуклеазой рестрикции, узнающей тетрануклеотиды, например, Sau3AI, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты различных размеров.

Глубину гидролиза обычно контролируют изменением времени инкубации или количества фермента. Одни молекулы, представленные на рисунке 48, расщеплены по всем сайтам, имеющимся на данной ДНК для гипотетической рестрицирующей эндонуклеазы (REI-сайтам), другие - только по некоторым.

 

 

Рис. 48. Схема проведения частичного гидролиза фрагмента ДНК эндонуклеазой рестрикции типа II

 

Из рисунка 48 видно, что исследователь получает набор фрагментов ДНК всевозможного размера и, что самое ценное, получает возможность экстрагировать последовательности ДНК, содержащие нативные, т.е. не фрагментированные участки. Например, при полном гидролизе с помощью REI исследуемый фрагмент ДНК гидролизуется по всем REI-сайтам, встречающимся на составляющей его нуклеотидной последовательности, образуя фрагменты a, b, c, и d. В случае, когда последовательности нуклеотидов ДНК-мишени содержат сайты для REI, например – между фрагментами a и b, частичный гидролиз дает возможность получить фрагменты a+b и a+b+c, которые содержат непрерывающуюся нуклеотидную последовательность фрагментов a+b. Таким образом, набор фрагментов, получаемых при неполном гидролизе эндонуклеазой REI исследуемой ДНК, дает возможность получить всю последовательность нуклеотидов, представленную такими фрагментами: a+b, a+b+c, b+c+d, c+d b+c и c+d. Полученные таким образом фрагменты ДНК-мишени для создания геномной библиотеки клонируют в векторах на основе фага λ (рис. 49), т.к. последние могут обеспечить клонирование фрагментов ДНК до 20 т.п.н. и эффективность трансформации клеток-реципиентов выше, чем у плазмидных векторов приблизительно в 1000 раз (см. раздел Генетические векторы).

Рис. 49. Схема создания геномной библиотеки с помощью вектора на основе ДНК λ-фага

Следующий после создания библиотеки этап – это поиск клона (клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода:

· гибридизацию с меченым ДНК-зондом (см. раздел Вспомогательные методы) с последующей визуализацией отобранных образцов (изотопная и неизотопная) (рис. 50);

· иммунологический скрининг (рис. 52);

· скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью.







Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 875. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!




Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...


Расчетные и графические задания Равновесный объем - это объем, определяемый равенством спроса и предложения...


Кардиналистский и ординалистский подходы Кардиналистский (количественный подход) к анализу полезности основан на представлении о возможности измерения различных благ в условных единицах полезности...


Обзор компонентов Multisim Компоненты – это основа любой схемы, это все элементы, из которых она состоит. Multisim оперирует с двумя категориями...

Шрифт зодчего Шрифт зодчего состоит из прописных (заглавных), строчных букв и цифр...

Краткая психологическая характеристика возрастных периодов.Первый критический период развития ребенка — период новорожденности Психоаналитики говорят, что это первая травма, которую переживает ребенок, и она настолько сильна, что вся последую­щая жизнь проходит под знаком этой травмы...

РЕВМАТИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ Ревматические болезни(или диффузные болезни соединительно ткани(ДБСТ))— это группа заболеваний, характеризующихся первичным системным поражением соединительной ткани в связи с нарушением иммунного гомеостаза...

Что такое пропорции? Это соотношение частей целого между собой. Что может являться частями в образе или в луке...

Растягивание костей и хрящей. Данные способы применимы в случае закрытых зон роста. Врачи-хирурги выяснили...

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИЗНОС ДЕТАЛЕЙ, И МЕТОДЫ СНИЖЕНИИ СКОРОСТИ ИЗНАШИВАНИЯ Кроме названных причин разрушений и износов, знание которых можно использовать в системе технического обслуживания и ремонта машин для повышения их долговечности, немаловажное значение имеют знания о причинах разрушения деталей в результате старения...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2025 год . (0.012 сек.) русская версия | украинская версия