Практическая работа №49

Практическая работа №49

Тема занятия: «Вирусоскопические и вирусологические методы диагностики вирусных инфекций»

Составила преподаватель: Якимова Л.М.

 

 

Минск

Практическая работа №49

Тема занятия: «Вирусоскопические и вирусологические методы диагностики вирусных инфекций»

 

Цель занятия: знакомство с вирусоскопическими и вирусологическими методами

диагностики вирусных инфекций.

Самостоятельная работа:

1. установление границ воздушного мешка и жизнеспособности куриного эмбриона с помощью овоскопа;

2. знакомство с методами заражения куриного эмбриона;

3. знакомство с методикой культивирования вирусов в культуре тканей;

4. изучение морфологии и цитопатического действия вирусов (ЦПД) с помощью мультимедийных ресурсов.

Методические указания к практической работе:

Используются два микроскопических способа выявления вирусов в материалах – вирусоскопия в иммерсионном и люминесцентном микроскопах и электронная микроскопия.

Вирусоскопия. В иммерсионном световом микроскопе обнаруживаются самые крупные элементарные тельца. Так, при натуральной оспе в жидкости кожных пузырьков находят внеклеточные вирионы Пашена, а в таких же везикулах при ветряной оспе – вирионы Арагао.

Легче при вирусных инфекциях обнаружить внутриклеточные включения. В большинстве своем они представлены скоплениями вирусов вперемежку с реактивными клеточными продуктами и в зависимости от места репликации вирионов находятся в цитоплазме или ядре клеток-хозяев. В частности, цитоплазматическими включениями являются тельца Гуарниери в эпителиальных клетках, скопления реовирусов и вирусов гриппа в них, тельца Бабеша – Негри - в нейроцитах, а ядерными включениями – адено-, папова- и герпесвирусные, правда, состоящие из клеточного материала. Изредка в одной и той же клетке вирусы, например коревой, формируют цитоплазматические и ядерные включения. По форме, размерам, структуре, отношению к красителям все эти и другие вирусные включения строго специфичны. Например, тельца Гуарниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму с диаметром 1-10 мкм, тельца Бабеша – Негри – овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включение реовирусов – серповидные, наполовину охватывающие клеточное ядро, коревые включения – в виде почкующихся мелких дрожжей. При этом для обнаружения телец Пашена и Арагао мазки подвергают «серебрению» по методу Морозова или обрабатывают вируснейтрализующими антителами, меченными флюорохромами. В высушенных мазках под иммерсионном микроскопом обнаруживают грозди кокковидных вирионов коричнево-черного цвета. В препаратах, обработанных меченными антителами (см. реакцию иммуннофлюоресценции), при люминесцентной микроскопии обнаруживают вне- и внутриклеточно расположенные вирионы в виде светящихся точек и конгломератов. Внутриклеточные вирусные включения окрашивают по Туревичу, Муромцеву и Романовскому-Гимзе. Тельца Бабеша – Негри по Туревичу окрашиваются в вишнево-красный цвет с черными зернами внутри, а цитоплазма нервных клеток, в которых они находятся – в светло-желтый; по Муромцеву – в бледно-фиолетовый, а цитоплазма клеток – в синий. Тельца Гуарниери, окрашенные по Туревичу, приобретают темно-синий цвет и тоже хорошо контрастируют в более светлой цитоплазме эпителия. По Романовскому-Гимзе ядра клеток окрашиваются в пурпурно-красный цвет, цитоплазма – в синий, а вирусные включения – в разные цвета и оттенки: тельца Бабеша-Негри, в частности, -в красный, включения вируса гриппа – в сине-фиолетовый, тельца Гуарниери – в пурпурно-красный, а реовирусов – в фиолетовый.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе вирусы идентифицируют по тонким деталям их ультраструктуры. С этой целью получают микрофотографии. Для этого материал, содержащий вирусы, наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые перлодиевой пленкой, и вирионы контрастируют 1%-ным уранилацетатом или фосфорно-вольфрамовым натрием. Покрывая вирусы, эти вещества создают вокруг них темный фон, а проникая вглубь между компонентами вирионов, способствуют выявлению деталей их структуры. Наконец, конфигурация вирионов отчетливо отпечатывается на матрицах-репликах высохших пленок пластмассы, раствором которых они заливаются. Симметрию и распределение белковых субъединиц в блоке-ансамбле вирусных кристаллов изучают с помощью рентгеноструктурного анализа.

Чаще всего вирусы выделяют из патологических материалов в культурах клеток и куриных эмбрионах, реже их культивируют в организме экспериментальных животных.

Выделение вирусов в культурах клеток. В большинстве случаев вирусы человека и животных выделяют на первичных культурах почек эмбрионов человека и обезьян или же на перевиваемых культурах клеток HeLa, Hep – 2, KB, Vero, FL. При этом исследуемым материалом заражают лишь те из них, в которых под малым увеличением микроскопа наблюдается хороший рост клеток. Отсосав питательную среду, в каждую пробирку или флакон вносят по 0,1-0,2мл материала, предварительно обработанного антибиотиками. После 30-60-минутного контакта материала с клетками его удаляют, покрывают свежей питательной средой и помещают в ультратермостат. О размножении вирусов в монослое судят по цитопатическому действию, выражающемуся в округлении и сморщивании клеток (пикорнавирусы), нарастающей деструкции пласта (герпесвирусы), нередко с первоначальной пролиферацией клеток (поксвирусы). Пикорнавирусы, герпесвирусы, многие тогавирусы, буньявирусы, разрушая монослой, образуют под агаровым покрытием бляшки («стерильные пятна»), каждая из которых представляет собой обособленную колонию вируса. При размножении некоторых вирусов образуются многоядерные клетки (парамиксовирусы, герпесвирусы). Целый ряд вирусов в цитоплазме и ядре формируют внутриклеточные включения округлой формы. Онкогенные вирусы вызывают трансформацию нормальных клеток в злокачественные, чему нередко предшествуют хромосомные изменения в ядрах монослоя. Пораженные инфекционными вирусами клетки обычно содержат огромное количество незрелых вирионов и их антигенов, которые выявляют с помощью флюоресцирующих антител. Если вирусы имеют большие размеры и, размножившись, отпочковываются от клеток, то в содержимом клеточного пласта под иммерсионным микроскопом, как уже отмечалось, удается обнаружить зрелые вирусные частицы. Размножение вирусов, не обладающих цитопатическим действием (ЦПД), можно установить с помощью реакции гемадсорбции, проявляющейся скучиванием добавленных эритроцитов на инфицированных клетках вследствие наличия у многих вирусов гемагглютининов (миксовирусы, тогавирусы). Гемагглютинацию можно увидеть и невооруженным глазом на предметном стекле, прибавив к капле культуральной жидкости соответствующие эритроциты. Например, миксовирусы гемагглютинируют эритроциты О группы человека, а 60% тогавирусов – эритроциты гусей. Ряд вирусов можно выявить по феномену интерференции, т.е. способности подавлять ЦПД другого вируса (вирусы лейкоза птиц интерферируют с вирусом саркомы Рауса). При этом, правда, надо исключить явление аутоинтерференции.

Выделение вирусов в курином эмбрионе. Для выделения вирусов из материалов используются, главным образом, 7-11-дневные эмбрионы белых кур. Заражение производят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО), в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок и тело зародыша. При этом выбор пути инфицирования определяется специфическими свойствами вирусов. Перед заражением яйцо помещают в овоскоп и, установив жизнеспособность эмбриона и границы воздушного мешка, спиртом и йодом обрабатывают над ним скорлупу. Наиболее распространен путь введения материала на ХАО. Для этого сбоку от воздушного мешка ножницами снимают скорлупу и слегка надрывают скорлупную оболочку. Вследствие давления воздуха ХАО западает, и на нее шприцем наносят 0,1-0,2мл исследуемого материала. Прокалывая ХАО и погружая иглу на 1-2мм, тем же количеством материала заражают аллантоисную полость. Для введения материала в амниотическую полость сложенными браншами пинцета осторожно прокалывают хорионаллантоис, захватывают амниотическую оболочку, приподнимают и после введения в её полость 0,05-0,10мл материала, опускают. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или стеклянным колпачком и заливают парафином. С меньшей долей вероятности в амниотическую полость удается ввести вирусный материал через прокол в центре тупого конца яйца, ориентируясь на местоположение эмбриона по его тени на скорлупе. Таким путем относительно легко удается заразить эмбрион в желточный мешок, поместив яйцо на подставку тупым конусом вправо и погружая иглу шприца на 3-4см вглубь. Попав в желточный мешок, в него вводят 0,2-1,0мл материала. Отверстие в скорлупе заливают каплей парафина.

Зараженные эмбрионы помещают в термостат, в котором поддерживается определенная влажность. Время инкубации эмбрионов и температурный режим зависят от свойств исследуемого вируса. Так, ортомиксовирусы необходимо культивировать при температуре 33⁰С, возбудитель натуральной оспы – не выше -38,5⁰С и, как исключение, вирус вакцины – при 40⁰С. Размножаясь в курином эмбрионе, вирусы на ХАО вызывают появление белесоватых куполообразных бляшек (поксвирусы), задержку развития и его гибель (тогавирусы), накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов и других антигенов (орто- и некоторые парамиксовирусы). При вскрытии эмбрионов материал забирают в следующем порядке: 1) отсасывают аллантоисную, затем амниотическую жидкость; 2) разрезают ХАО и содержимое всего яйца выливают в чашку Петри; 3) отделяют амниотическую оболочку, эмбрион и желточный мешок, захватив его за пупочный канатик; 4) последней извлекают ХАО. При этом пытаются обнаружить микроскопические изменения на хорионаллантоисной и амниотической оболочках.

Выделение вирусов в организме животных. В организме животных культивируют те вирусы, которые плохо или совсем не размножаются в культурах клеток и курином эмбрионе. При этом, выделяя коксаки-, тога- и арена- вирусы, материалом предпочтительнее заражать мышей – сосунков, а в случаях, требующих выделения онкогенных вирусов, - сосунков белых крыс и сирийских хомяков. Количественный выход (титр накопления) вирусов в организме животных во многом зависит от их тропизма и, следовательно, от путей инфицирования, определяющих возникновение и развитие вирусной инфекции. Поэтому, выделяя нейротропные вирусы (рабдо-, тога-, буньявирусы), патологический материал надо вводить под твердую мозговую оболочку или в вещество головного и спинного мозга. Респираторные вирусы выделяют путем интраназального заражения наркотизированных белых мышей (ортомиксовирусы), инокуляцией содержимого носоглотки в слизистую оболочку защечных мешков сирийских хомяков (аденовирусы), введением содержимого везикул в скарифицированную кожу и конъюнктиву глаза кроликов и морских свинок (покс- и герпесвирусы).

Отдельные вирусы вызывают у животных развитие характерных параличей (лисса- и тогавирусы); специфические патогистологические изменения в тканях, например в межлопаточном буром жире (пикорна- и тогавирусы); образование папул и везикул на коже и конъюнктиве глаза (поксвирусы) и другие проявления.

Изучив патогенные эффекты вирусов в клеточном монослое, курином эмбрионе и организме животного, выделенный вирус на заключительном этапе вирусологического исследования идентифицируют в серологических реакциях.

Часто во время беременности у женщины обостряются хронические заболевания, снижается иммунитет и поэтому будущая мама становится особенно уязвимой для всякого рода инфекционных заболеваний. Есть группа инфекций, которые чрезвычайно опасны для беременных.

TORCH-инфекции.

По первым буквам латинских названий входящих в нее инфекций эту группу принято называть TORCH-инфекциями или инфекциями TORCH-комплекса.

Расшифровывается аббревиатура TORCH следующим образом:

Т — токсоплазмоз (toxoplasmosis)

О — другие инфекции (others)

R — краснуха (rubella)

С — цитомегаловирусная инфекция (cytomegalovirus)

H — герпес (herpes simplex virus)

О — others (другие) — подразумевает такие влияющие на плод инфекции, как гепатит В и гепатит С, сифилис, хламидиоз, гонококковая инфекция, листериоз. Недавно в этот перечень включили ВИЧ-инфекцию, ветряную оспу, энтеровирусную инфекцию.

Однако, как правило, в группу ТОРЧ -инфекций включают только четыре перечисленных заболевания: токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирус и герпес.

Особенность ТОРЧ -инфекций в том, что при первичном заражении ими во время беременности они могут оказывать пагубное действие на все системы и органы плода, особенно на его центральную нервную систему, повышая риск выкидыша, мертворождения и врожденных уродств ребенка, формирования пороков его развития, вплоть до инвалидности.