Адсорбционная хроматография

В адсорбционном варианте жидкостной хроматографии в зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографии. В НФХ используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в ОФХ – неполярный адсорбент и полярные подвижные фазы. В обоих случаях выбор подвижной фазы часто важнее, чем выбор неподвижной. Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества. Подвижная фаза, т.е. растворитель должна обеспечить различную емкость колонки и эффективное разде­ление за приемлемое время.

Неподвижные фазы

 

Адсорбенты различных типов (полярные и непо­лярные) проявляют неодинаковую селективность по отношению к разделяе­мым соединениям. В качестве адсорбентов применяют тонкодисперсные пористые материалы с удельной поверхностью более 50 м²-г^-1.

Полярные адсорбенты (Si0₂, А1₂0₃, оксиды металлов, флорисил и др.) имеют на поверхности слабокислотные ОН-группы, способные удерживать вещества с основными свойствами. Эти адсорбенты применяют главным образом для разделения неполярных соединений и соединений со средней полярностью.

Недостаток полярных адсорбентов — высокая чувствительность к со­держанию воды в растворителях: например, силоксановые группы –Si-О-Si- на поверхности Si0₂ в присутствии воды переходят в силанольные ≡Si-OH, при этом изменяются свойства поверхности и результаты стано­вятся невоспроизводимыми. Для ВЭЖХ применяют полярные сорбенты с привитыми полярными группами (амины, диолы и др.), что позволяет менять селективность, подбирая подходящий элюент.

Неполярные адсорбенты (графитированная сажа, кизельгур, диатомит) не проявляют селективности к полярным молекулам. Используют также сорбенты с привитыми неполярными фазами, например силикагель с алкилсилильными группами от С₂ до С₂₂. Чтобы на силикагель легче было привить неполярную неподвижную фазу, проводят с цианизацию Si0₂ три- метилхлорсиланом:

и получают соединения типа

Экранировать силанольные ОН-группы силикагеля удается алифатиче­скими углеводородами с С₃ и С₄, но получить относительно высокие зна­чения емкости к' и большее удерживание удается при введении более длин­ных алкильных цепочек, предпочтительнее с С₁₈. Например, у сорбента, называемого «щеточным», поверхность силикагеля покрыта длинными угле­водородными цепями:

 

Такие сорбенты с успехом используют при определении многих соеди­нений.

Кроме указанных сорбентов, используют поверхностно-пористые носи­тели (ППН). Это могут быть жесткие непористые носители (стеклянные ша­рики), покрытые тонким пористым слоем активного полярного или неполяр­ного сорбента. Такие сорбенты оказывают малое сопротивление потоку, за счет чего увеличивается скорость анализа.

 

Подвижные фазы

 

Как уже отмечалось, в ЖХ важен выбор подвижной фазы, поскольку она оказывает большою влияние на селективность разделе­ния, эффективность колонки и скорость движения хроматографической по­лосы. Подвижная фаза должна растворять анализируемую пробу, обладать малой вязкостью (коэффициенты диффузии компонентов анализируемой пробы должны быть достаточно большими), из нее должно быть возможным выделение разделенных компонентов. Подвижная фаза должна быть инерт­ной по отношению к материалам всех частей хроматографа, безопасной, де­шевой, подходящей для данного детектора.

Как было сказано, разделения достигают, меняя элюирующую силу под­вижной фазы — растворителя. Элюирующая сила растворителя показывает, во сколько раз энергия сорбции данного элюента больше, чем энергия сорб­ции элюента, выбранного в качестве стандарта, например н-гептана. Раство­рители (элюенты) делят на слабые и сильные. Слабые растворители слабо адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения сорбируемых веществ (сорбата) высокие. Сильные растворители сильно ад­сорбируются, поэтому D сорбата низкие. Растворитель тем сильнее, чем вы­ше растворимость в нем анализируемой пробы, чем сильнее взаимодействие растворитель—сорбат.

Имеются данные об относительной силе растворителей для разных ад­сорбентов. Для Si0₂ сила растворителей увеличивается в ряду: пентан (0) <

СС1₄ (0,11) < бензол (0,25) < СНС1₃ (0,26) < СН₂С1₂ (0,32) < ацетон (0,47) <

диоксан (0,49) < ацетонитрил (0,5).

Элюирующая сила определяется полярностью растворителя. В нормаль­но-фазовой хроматографии с увеличением полярности растворителя элюи­рующая сила растворителя растет, в обращенно-фазовом варианте — снижа­ется. В качестве меры относительной полярности принимают параметр Гильдебранда Р. Расположение растворителей в соответствии с возрастанием

их элюирующей силы называют элюотропным рядом. В жидкостной ад­сорбционной хроматографии элюотропный ряд Снайдера имеет вид (в скоб­ках приведены значения элюирующей силы): пентан (0) < н-гексан (0,01), гептан (0,01) < циклогексан (0,04) < СС1₄ (0,18) < бензол (0,32) <

< CHG₃ (0,38) < ацетон (0,51), этанол (0,88) < вода, СН₃ОООН (очень большая).

Для обращенно-фазовой хроматографии на силикагеле с С₁₈ элюотропный ряд имеет вид: метанол (1,0) < ацетонитрил (3,1), этанол (3,1) < изопро­панол (8,3) < н-пропанол (10,1) < диоксан (11,7).

Часто применяют не индивидуальные растворители, а их смеси. Незна­чительные добавки другого растворителя, особенно воды, существенно уве­личивают элюирующую силу элюента. Например, н-пентан (0,00), н-пентан + 10% изопропилхлорида (0,10), н-пентан + 4% эфира (0,2) и т. д.

При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в ка­честве элюента может не разделить все компоненты пробы за приемлемое время, в этом случае применяют метод градиентного элюирования. Для уве­личения силы элюента в процессе хроматографирования последовательно применяют все более сильные элюенты. Это позволяет элюировать все более сильноудерживаемые вещества за меньшее время.

Установлены некоторые эмпирические правила, помогающие при выбо­ре элюента. Сорбция, как правило, увеличивается с ростом числа двойных связей и ОН-групп в соединениях. Сорбция уменьшается в ряду органиче­ских соединений: кислоты > спирты > альдегиды > кетоны > сложные эфиры > ненасыщенные углеводороды > насыщенные углеводороды. Для разделе­ния веществ разной полярности и для разделения соединений разных классов применяют нормально-фазовую хроматографию: из неполярных подвижных фаз соединения разных классов выходят из колонки с полярным адсорбентом за разное время (время удерживания соединений с разными функциональ­ными группами увеличивается при переходе от неполярных соединений к слабополярным). Для очень полярных молекул t_R так велики, что при ис­пользовании неполярного элюента анализ невозможен. Для уменьшения времени удерживания полярных сорбатов переходят к полярным элюентам. В обращенно-фазовом варианте неподвижная обращенная фаза сильнее ад­сорбирует неполярные компоненты из полярных элюентов, например из во­ды. Снижая полярность элюента добавлением менее полярного растворителя (метанол), можно уменьшить удерживание компонентов.

Механизм удерживания в ЖХ чаще бывает смешанным, т. е. удерживание про­исходит по адсорбционному, распределительному, эксклюзионному механизмам. Выделить преобладающий тип часто сложно или невозможно. В адсорбционной хроматографии распределение сорбата между подвижной жидкой и неподвижной твердой фазами происходит за счет взаимодействия двух видов: неспецифических (дисперсионные, индукционные, ориентационные) и специфических, вносящих ос­новной вклад в величины удерживания, под которыми понимают, например образо­вание водородных связей с неподвижной твердой фазой. Механизм удерживания зависит от природы сорбента. На полярных адсорбентах удерживание компонентов пробы обусловлено их взаимодействием с гидроксильными группами адсорбента (силикагель, оксид алюминия и др.) с образованием Н-связей. Полярные молекулы удерживаются сильнее неполярных. На обращенно-фазовых сорбентах с привитыми фазами С₁₈ механизм удерживания более сложен. Привитые молекулы С₁₈ удержи­вают сорбат за счет неспецифических взаимодействий. Кроме того, возможно взаи­модействие силанольных групп, не прореагировавших с октадецилсиланом из-за стерических препятствий, с молекулами растворителей, а также с металлами и другими компонентами по механизму ионного обмена. Также было высказано предположение, что на поверхности «щеточного» сорбента за счет адсорбции удерживается слой жидкой фазы, обогащенной менее полярным растворителем из подвижной фазы, т. е. состав этого слоя отличается от состава подвижной фазы, и разделение происходит за счет распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Поэтому разделение на «щеточных» сорбентах иногда относят к распределительной хроматографии. Четко разграничить адсорбционную и распределительную хромато­графии трудно.