ЖИДКОСТНАЯ КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую колонку, представляющую собой стеклянную трубку диаметром 0.5-5 см и длиной 20-100 см, заполненную сорбентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Элюент движется под воздействием силы тяжести. Скорость его движения можно регулировать имеющимся внизу колонки краном. Пробу анализируемой смеси помещают в верхнюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит разделение компонентов. Через определенные промежутки времени отбирают фракции элюента, которые анализируют каким-либо методом, позволяющим измерять концентрацию определяемых веществ.

Усовершенствование аппаратуры под современные возможности прибо­ростроения сделало жидкостную колоночную хроматографию одним из наиболее перспективных и совершенных методов анализа. Этот метод получил название высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ).

Комплект современного оборудования для ВЖХ, как правило, состоит из двух насосов, управляемых микропроцессором и подающих элюент по определенной программе. Состав и скорость подачи элюента в ходе анализа может изменяться линейно или каким-либо другим образом в зависимости от условий анализа. Для обеспечения высокой скорости анализа насосы создают давление до 40 МПа (400 атм.). Проба вводится через специальное устройство (инжектор) непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографическую колонку вещества детектируются высокочувствительным проточным детектором, сигнал кото­рого регистрируется и обрабатывается микро-ЭВМ. При необходимости автоматически в момент выхода пика предусматривается отбор фракций.

Колонка представляет собой трубку из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2-6 мм и длиной 10-25 см, отполированную внутри. Колонка заполнена частицами сорбента размером 3.5, 5 или 10 мкм обычно сферической формы. Для заполнения через колонку прокачивают суспензию сорбента в специально подобранном растворителе под давлени­ем 50-80 МПа. Такие колонки обладают высокой разделяющей способностью до 40-150 тысяч теоретических тарелок на 1 метр.

Детекторы. В качестве детекторов в жидкостной хроматогра­фии обычно используют высокочувствительные спектрофотометры, которые позволяют детектировать до 10 М^-10 соединений, поглощающих свет в УФ или видимой части спектра (190-800 нм). Существуют высокоскоростные спектрофотометры в качестве детекторов, регистрирующие спектр в течение 0.01-0.05 с, что можно использовать для идентификации соеди­нений. Для соединений, не поглощающих в этой области спектра, применяют универсальный дифференциальный рефрактометр. При анализе соединений, способных к окислению или восстановлению, применяют элект­рохимический детектор - по сути миниатюрный полярограф. Используют также флуоресцентные детекторы и детекторы по электропроводности, последний главным образом в ионообменной хроматографии.

Неподвижные фазы, применяемые в жидкостной хромато­графии, не должны смешиваться с ПФ, должны быть механически и химически устойчивыми в условиях анализа и обеспечивать требуемую селективность и эффективность.

Силикагель - одна из широко используемых НФ, который относится к специфическим сорбентам. Адсорбция на нем чаще всего происходит вследствие образования водородных связей адсорбируемого вещества с поверхностными силанольными группами Si-OH. Чем большее количество водородных связей способно формировать вещество, тем сильнее оно удерживается на силикагеле. Поверхность силикагеля имеет слабокислый характер (рН = 3-5), поэтому соединения основного характера сорбиру­ются на нем лучше, чем на основных сорбентах. Силикагели применяют для разделения различных классов соединений: углеводородов, стерои­дов, спиртов, фенолов, альдегидов, органических кислот, аминов, липидов, комплексных соединений и других.

Оксид алюминия. Поверхность этого сорбента, образованная ионами алюминия и кислорода, способна создавать сильное электростатическое поле, обладающее поляризующими свойствами. Поэтому на оксиде алюминия соединения, имеющие систему легко смещаемых электронов (непредельные, ароматические и другие) сорбируются в большей степени, чем на силикагеле.

При хроматографировании на силикагеле и оксиде алюминия очень большое значение имеет количество воды, содержащееся на поверхности этих сорбентов. Для получения воспроизводимых результатов необходимо поддерживать постоянный уровень воды, как на поверхности сорбента, так и в элюенте. При смене элюента требуется довольно продолжительное время для установления равновесия в новой хроматографической системе.

Модифицированные сорбенты. В высокоэффек­тивной жидкостной хроматографии подавляющее большинство разделений проводят на модифицированных сорбентах. Химической модификации под­вергают, как правило, только силикагель. Силанольные группы на поверх­ности силикагеля заменяют различными органическими соединениями, что приводит к значительному изменению селективности НФ. В качестве полярных модифицированных сорбентов используют силикагели с привитыми цианопропильными -(CH₂)₃-CN, аминопропильными -(CH₂)₃-NH₂ и оксипро­пильными -(CH₂)₃-OH группами. На модифицированных полярных сорбентах значительно быстрее, чем на силикагеле, устанавливается равновесие при переходе от элюента к элюенту, а также значительно лучше воспроизводимость результата анализа. В качестве неполярных модифици­рованных сорбентов используют силикагели с привитыми этильными (С₂), октильными (С₈), октадецильными (С₁₈) и фенильными радикалами. Эти сорбенты имеют большое сродство к гидрофобным молекулам.